核膜透過過程の新規定量化システムの構築と核膜輸送の基質認識性、機能多様性の解析

新型核膜渗透过程定量体系的构建及核膜转运底物识别和功能多样性分析

• 批准号: 15790084
• 负责人: 秋田 英万
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790084/
• 关键词: 遺伝子デリバリー; 細胞内動態; エンドサイトーシス脱出; 核膜誘過; 核膜透過

遺伝子ベクターを最適化する上で、エンドソームから細胞質への脱出と、それに引き続く核膜透過過程の効率を定量化する事は重要である.本研究においては、共焦点レーザー顕微鏡により得られる画像を基に定量化を試み、細胞内動態の定量的解析法を構築した。さらに、PCRを用いて、核内への遺伝子到達量を測定する系についても確立し、これらを用いて各種遺伝子導入法の違いによる細胞内遺伝子動態の比較を行った。stearyl R8及びlipofectAMINEによる導入時においては、R8と比較してendosome/lysosomeからの脱出過程とそれに伴う核内移行過程が非常に早い事が明らかとなり、遺伝子発現活性と矛盾をしない結果となった。また、stearyl R8を用いた導入においては、エンドソームの脱出とそれに続く核膜透過が時間依存的に上昇するのに対し、lipofectAMINEを用いた際には、特に30分という非常に早い時間で細胞質や核に遺伝子が移行する事が明らかとなり、エンドサイトーシス以外の経路を介した取込み機構の存在と、効率的な核移行性が示唆された。このような細胞内遺伝子定量解析は、遺伝子ベクターの新たな細胞内挙動メカニズムを明らかにするのみでなく、核指向性新規遺伝子ベクターの開発に有用であろうと考えられる。現在、この実験系を用い、より究極的な課題として、なぜウイルスは人工ベクターと比較して遺伝子発現が悪いのかを細胞内動態の観点から明らかにする事を試みている.

It is important to quantify the efficiency of the nuclear membrane permeation process by optimizing the molecular structure of the nucleus and optimizing the molecular structure of the nucleus. In this study, a quantitative analysis method for intracellular dynamics was constructed based on confocal microscopy. To compare the dynamics of intracellular gene expression using PCR, PCR, and gene expression in the nucleus. Stearyl R8 and lipofectAMINE are introduced into the nucleus at very early stages of endosome/lysosome migration, resulting in activity and contradiction. In addition, when using Stearyl R8, the time dependent rise of nuclear membrane permeability is observed, especially when using lipofectAMINE, the time dependent rise of cytoplasmic and nuclear membrane migration is observed, especially when using lipofectAMINE, and the time dependent rise of nuclear membrane permeability is observed, especially when using cytoplasmic and nuclear membrane migration is observed, especially when using lipofectAMINE. The quantitative analysis of intracellular genes is useful in the development of new intracellular genes with nuclear orientation. Now, this system is used in the middle, the ultimate problem, and it is difficult to compare the artificial environment and the genetic process, and it is difficult to find the intracellular dynamic point.

项目成果

Quantitative three dimensional analysis of the intracellular trafficking of plasmid DNA transfected by a nonviral gene delivary system using confocal laser scanning microscopy

使用共焦激光扫描显微镜对非病毒基因传递系统转染的质粒 DNA 的细胞内运输进行定量三维分析

• 发表时间: 2004
• 期刊: Mol Ther 9(3)
• 作者: Akita H;Ito R;Khalil I;Futaki S;Harashima H
• 通讯作者: Harashima H

Kamiya H, Akita H, Harashima H.: "Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations in gene therapy"Drug Discov Today. 18(21). 990-996 (2003)

Kamiya H、Akita H、Harashima H.：“基因治疗中的药代动力学和药效学考虑因素”Drug Discov Today。

Akita H, Ito R, Kalil I, Futaki S, Harashima H: "Quantitative three dimensional analysis of the intracellular trafficking of plasmid DNA transfected by a nonviral gene delivary system using confocal laser scanning microscopy"Mol Ther. In press. (2004)

Akita H、Ito R、Kalil I、Futaki S、Harashima H：“使用共焦激光扫描显微镜对非病毒基因传递系统转染的质粒 DNA 的细胞内运输进行定量三维分析”Mol Ther。