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生細胞における細胞内蛋白質輸送の新たなリアルタイム可視化法の開発

开发一种新的活细胞内细胞内蛋白质运输实时可视化方法

基本信息

批准号：
04F04190
负责人：
大野博司
金额：
$ 0.77万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞内蛋白輸送の研究はGFPをはじめとする蛍光蛋白質の開発により飛躍的に発展した。しかしこれまでの方法では、細胞内のある特定の部位(オルガネラ)に局在する蛋白質が時間とともにどこに移動するかをリアルタイムで追跡することは事実上不可能であった。最近開発されたGFP変異体であるphotoactivatable(PA)-GFPは、400nm付近の光により初めて活性化されて蛍光を発するようになる。そこで本研究では、特定のオルガネラに局在するPA-GFPキメラのみを活性化し、その挙動を共焦点レーザー顕微鏡でタイムラプス観察することにより、生細胞における蛋白輸送のリアルタイム可視化の新技術を開発することも目的とした。新規に合成されたトランスフェリン受容体(TFR),LDL受容体(LDLR)はゴルジ体から細胞膜へと輸送され、その後細胞膜とエンドソームを循環するとされるがその動態は不明である。そこでその細胞内輸送をモニターするために、これらの蛋白質とPA-GFPとのキメラ蛋白(PA-GFP-TFR, PA-GFP-LDLR)を作成した。HeLa細胞に遺伝子導入されたPA-GFP-TFR, PA-GFP-LDLRはTFR、LDLRそのものと同様に細胞膜およびエンドソームに局在することを確認した。また、生細胞内であるオルガネラに局在するPA-GFPキメラ蛋白のみを活性化するためには、PA-GFPとは異なる自家蛍光を発する蛋白質が必要である。そのために、golgin97のトランスゴルジ網(TGN)局在を決定するドメインであるgripドメインとRFPとのキメラ蛋白grip-RFPを作成した。HeLa細胞に導入されたgrip-RFPは予想通りTGNに局在することを光顕・電顕にて確認した。PA-GFPは単光子レーザーより多光子レーザーによる励起の方が励起効率、励起される範囲の正確さ、細胞に与えるダメージの全てにおいて遊離であることを確認した。PA-GFP-TFR、grip-RFPを共発現したHeLa細胞を多光子レーザーにて励起し、生細胞における蛍光観察を行うことにより、PA-GFP-TFRはTGNからエンドソームを経て細胞膜へと向かうことが示唆された。現在論文作成中である。

The study of intracellular protein transport is a major step forward in the development of GFP. This method is not possible because of the presence of specific sites in the cell. Recently, GFP has been developed as a photoactivatable(PA)-GFP protein with a wavelength of 400nm. This study aims to develop a new technique for visualizing protein transport in living cells by activating PA-GFP and activating PA-GFP molecules in certain living cells and by activating PA-GFP molecules in confocal microscopy. The new regulation of synthesis of TFR, LDLR receptors, cell membrane transport, post-cell membrane transport, and cycle dynamics is unknown. The intracellular transport of PA-GFP proteins (PA-GFP-TFR, PA-GFP-LDLR) was studied. HeLa cell vector transfer PA-GFP-TFR, PA-GFP-LDLR and TFR, LDLR and other similar cell membrane transfer systems were identified. PA-GFP protein is essential for the activation of PA-GFP protein in the production of intracellular proteins. The TGN Bureau is making decisions on the selection of grip-RFP and the selection of grip-RFP. HeLa cells were introduced into the grip-RFP system, which was confirmed by light and electricity. PA-GFP is a multi-photon laser with high excitation efficiency, high excitation accuracy, and low excitation efficiency. PA-GFP-TFR and grip-RFP were co-expressed in HeLa cells, and PA-GFP-TFR and TGN were co-expressed in HeLa cells. Now the paper is made in.