RNA干渉とクロマチン修飾による遺伝子発現制御の解明と薬剤開発

通过 RNA 干扰和染色质修饰阐明基因表达调控以及药物开发

• 批准号: 17790072
• 负责人: 佐々木 貴史
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790072/
• 关键词: RNA干渉; ヒストン; メチル化

・GFP-SUV39H1ベクターの構築及び生細胞:観察SUV39H1タンパクの細胞内局在を明らかにするために、GFP融合型SUV39H1発現ベクターを構築した。この発現ベクターを用いてHeLa細胞を形質転換しGFP融合型SUV39H1タンパク質生細胞内での局在部位の観察を行った。その結果、GFP融合型SUV39H1タンパクは核内に局在し、核内でもDAPI染色で強く染まる領域から強いシグナルが観察された。また、細胞分裂期の生細胞連続写真では、GFP融合型SUV39H1タンパクのシグナルは、染色体の分裂像と完全に重なって観察された。これらのことから、GFP融合型SUV39H1タンパクは、核内の染色体上に局在していることが示された。今後は、GFP融合型SUV39H1タンパク発現系及びArgonauteタンパク発現系を用いて、共発現時の局在の変化やヒストンメチル化状態の変化を明らかにしていく。・SUV39H1タンパク及びSUV39H2タンパクの相互作用解析SUV39H1タンパク及びSUV39H2タンパクが相互作用を示すか確認するために、FLAGタグ融合SUV39H1及びHAタグ融合SUV39H2の発現ベクターを構築した。これらの発現ベクターを用いてHEK293細胞を形質転換し、細胞抽出液を用いて共免疫沈降法を行った。抗FLAGタグ抗体で免疫沈降を行い、抗HAタグ抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った結果、HAタグ融合SUV39H2由来のバンドがみられた。これらの事から、SUV39H1タンパク及びSUV39H2タンパクが相互作用することが明らかになった。・部分欠損変異体を用いた結合領域解析SUV39H1タンパクとArgonauteタンパクの相互作用部位を同定するために、クロモドメイン領域とSET領域ドメインを含む部分欠損変異体発現ベクターを構築した。これらの部分変異体とEIF2C1/hAGO1との相互作用解析を行った結果、2つの変異体とも相互作用を示した。これらは、内在性のSUV39H1タンパクやSUV39H2タンパクなどの影響と考え、再解析を行っている。また、DICERタンパクとArgonauteタンパクの相互作用部位を同定するために、部分欠損変異体発現ベクターを構築し解析を行った結果、DICERのRIBOc-A領域中に存在する127アミノ酸残基からなる領域が結合に関与している事を明らかにした。(Sasaki and Shimizu, Gene in press)

GFP-SUV39H1 construction and development of cells: observation of SUV39H1 construction and development of GFP fusion SUV39H1 This discovery was carried out in HeLa cells by morphological transformation of GFP fusion SUV 39H1 cells. As a result, GFP fusion SUV39H1 was detected in the nuclear region and in the nuclear region by DAPI staining. In addition, the GFP fusion SUV39H1 gene was detected during cell division. The GFP fusion SUV39H1 is located on the chromosome inside the nucleus. In the future, GFP fusion SUV39H1 and Argonaute fusion development systems will be used to develop the current state of the transition. SUV39H1 and SUV39H2 interaction analysis SUV39H1 and SUV39H2 interaction demonstration confirmation FLAG fusion SUV39H1 and SUV39H2 fusion development The development of HEK293 cells was carried out by means of morphological changes and cell extracts by means of co-immunoprecipitation Anti-FLAG antibodies are used in immune sedimentation, anti-HA antibodies are used in immune sedimentation analysis, HA fusion SUV39H2 is used in immune sedimentation analysis. SUV39H1 and SUV 39H2 interact with each other. Part of the loss is different from the use of the combination of domain analysis SUV39H1, Argonaute and other interaction sites are determined, including the partial loss of different types of discovery. The results of the analysis of the interaction between EIF2C1 and hAGO1 show that the interaction between EIF2C1 and hAGO1 is different from that between EIF 2C 1 and hAGO 1. SUV39H1, SUV39 H2, SUV39 H2, SUV 39H1, SUV39H2, SUV 39 H1, SUV39H2, SUV39H2, SUV 39 H1, SUV39H2, SUV 39 H3, SUV 39 H The interaction site of DICER was identified, and the partial loss of heterogeneic protein was analyzed. The results showed that there were 127 amino acid residues in DICER's RIBOc-A domain, and the binding relationship between DICER and ARgonaute was clarified. (Sasaki and Shimizu, Gene in press)

项目成果

Conservation of a Unique Amino Acid Sequence in Human DICER Protein Essential for Binding to Argonaute Family Proteins

人 DICER 蛋白中独特氨基酸序列的保护对于与 Argonaute 家族蛋白结合至关重要

• 期刊: Gene (in press)
• 作者: Sasaki;T.;Shimizu;N.
• 通讯作者: N.