敗血症性ショックに関与するMIF遺伝子の発現調節機構の解明

本年度は、昨年度にクローニングしたMIF遺伝子を用い、大腸菌two hybrid法によって相互作用する遺伝子を同定することを目指した。MIF遺伝子を用いてベイトベクターを構築し、DNA配列決定を行い、DNA配列及びタンパク質のフレームがずれていないことを確認した。このベクター及びヒト精巣から作成したcDNAライブラリーを用いて、同時に大腸菌の形質転換を行った。この遺伝子ライブラリーから導入された遺伝子が、MIF遺伝子と相互作用する遺伝子であった場合、薬剤耐性遺伝子が発現する。これらの系を用いてMIF遺伝子と相互作用する遺伝子のスクリーニングを行った。これらのベクターを用いて大腸菌を形質転換し、96の陽性クローンを得た。これらのクローンを培養しDNAを抽出及び遺伝子配列決定をおこなった。詳細に解析を行った結果、7クローンがMIF自身であった。これら7クローンのMIFcDNAの5'末端は同一箇所ではないことから、独立して相互作用する遺伝子としてクローニングされた。これらのことから、大腸菌two hybrid法の結果は信頼性が高いと思われる。また、MIFはホモ3量体を形成することが報告されていることから、MIF同士で相互作用を示唆している本結果は妥当であると考えられる。しかしながら、残りのクローンはフレームの合わない遺伝子や、疑陽性と思われる遺伝子であり、新たな結合因子を同定するにはいたらなかった。

本年度は、昨年度にクローニングしたMIF遺伝子を用い、大腸菌two hybrid法によって相互作用する遺伝子を同定することを目指した。MIF遺伝子を用いてベイトベクターを構築し、DNA配列決定を行い、DNA配列及びタンパク質のフレームがずれていないことを確認した。このベクター及びヒト精巣から作成したcDNAライブラリーを用いて、同時に大腸菌の形質転換を行った。この遺伝子ライブラリーから導入された遺伝子が、MIF遺伝子と相互作用する遺伝子であった場合、薬剤耐性遺伝子が発現する。これらの系を用いてMIF遺伝子と相互作用する遺伝子のスクリーニングを行った。これらのベクターを用いて大腸菌を形質転換し、96の陽性クローンを得た。これらのクローンを培養しDNAを抽出及び遺伝子配列決定をおこなった。詳細に解析を行った結果、7クローンがMIF自身であった。これら7クローンのMIFcDNAの5'末端は同一箇所ではないことから、独立して相互作用する遺伝子としてクローニングされた。これらのことから、大腸菌two hybrid法の結果は信頼性が高いと思われる。また、MIFはホモ3量体を形成することが報告されていることから、MIF同士で相互作用を示唆している本結果は妥当であると考えられる。しかしながら、残りのクローンはフレームの合わない遺伝子や、疑陽性と思われる遺伝子であり、新たな結合因子を同定するにはいたらなかった。