糖尿病網膜症における毛細血管障害・脱落予防と正常血管の再構築

点击翻译按钮获取中文摘要

平成17年度細胞レベルでの検討:網膜血管細胞死抑制-安定血管の再構築に必要なシグナルが明らかとした。1.網膜血管内皮細胞、周皮細胞によるin vitroの系で高血糖・過酸化水素などの酸化ストレスを負荷することによりAktなどの細胞内生存シグナルとJNKなどの細胞死シグナルがどのように修飾されるかを2次元電気泳動、リン酸化特異的抗体を用いたwestern blot,ラジオアイソトープを用いた酵素活性測定により検討した。2.網膜血管周囲を形成する網膜ミュラー細胞、神経節細胞、視細胞、色素上皮細胞などによるin vitroの系で高血糖、酸化ストレスを負荷することにより血管に作用するVEGF, PDGF, IGFなどの増殖因子、Fasなどの細胞死誘導因子、Ang, ephrinなどの血管安定化因子のRNAレベルでの発現をAffymetrixマイクロアレイ解析装置でスクリーニングし結果をApplied Biosystemsリアルタイム定量PCR装置にて確認した。同時に蛋白レベルでの細胞外への放出をELISA, Western blotにて検討した。3.高血糖・酸化ストレスの血管内皮細胞・周皮細胞の増殖、遊走、管腔形成、アポトーシスに及ぼす影響を検討した。増殖は細胞内DNA濃度測定か3H-thymidine取り込み能にて測定し、遊走能はboyden-chamber法、管腔形成はマトリジェルをもちいたin vitroの管腔形成、アポトーシスはDNA断片化・TUNEL法により検討した。4.高血糖・酸化ストレスのタイトジャンクションなど血管細胞間の接着に関与する分子の発現量に対する影響をReal time quantitative PCR, Northern blot解析やWestern blot解析により検討する。またそれらの分子のチロシン、セリンースレオニンリン酸化を抗リン酸化抗体を用いた免疫沈降-western blotにより解析した。さらにIn vitroの透過性を電気抵抗およびアルブミン透過率等を測定する事により検討した