筋フィラメント長制御の1分子ナノ解析-筋タンパク質動態の可視化-

肌丝长度控制的单分子纳米分析 - 肌肉蛋白质动力学可视化 -

基本信息

批准号：
18740257
负责人：
藤田英明
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

筋タンパク質動態の可視化を試みるため、生細胞内分子イメージングに適した高度発達型培養筋細胞系の開発と、作成した高度発達型培養筋細胞内における分子イメージングを行った。高度発達型培養筋細胞は、常法で得たC2C12筋管細胞に電気パルス刺激を与え、運動させることによって作成した。得られた高度発達型培養筋細胞は常法で得られる筋管細胞よりも発達したサルコメア構造を持ち収縮力も大きかった(Fujita et al., Exp. Cell. Res. 2007)。この高度発達型培養筋細胞を用い、筋肉におけるインスリン依存的糖取り込みに重要な役割を果たすGLUT4分子の動態解析を行った。GLUT4分子を従来の蛍光色素よりも明るく退色しにくい蛍光量子ドットでラベルし、リアルタイム共焦点顕微鏡とEMCCDカメラによって観察した。また、GLUT4分子の位置は蛍光強度分布を2次元ガウス近似し、頂点の座標を求めることによってナノ精度で求めた。GLUT4分子は基底状態では筋構造に固く固定されていたが、インスリン刺激を与えることによってゆっくりと動き出した。さらに、周期的に収縮中の筋肉において、弛緩時のGLUT4分子の座標を追跡すると、運動中の筋肉では運動していない筋肉中と比べてGLUT4分子の動きが激しくなっていることがわかった。これは脂肪細胞中のGLUT4分子には見られない特色であり、筋肉と脂肪細胞では、GLUT4分子は全く異なるメカニズムによって膜移行を達成している可能性が示唆された。

为了可视化肌肉蛋白动力学，我们开发了一种高度发达的培养肌肉细胞系，适用于活细胞中的分子成像，并在产生的高度发达培养的肌肉细胞中进行了分子成像。通过将电脉冲刺激施加到通过常规方法获得的C2C12肌管细胞并进行锻炼来产生高度发达的培养肌肉细胞。与通过常规方法获得的肌管细胞相比，获得的高度发达培养的肌细胞具有更发达的肌节结构（Fujita等人，Exp。Cell。Res。2007）。使用这种高度发达的培养肌肉细胞，我们分析了GLUT4分子的动力学，这些动力学在肌肉中胰岛素依赖性糖摄取中起着重要作用。 GLUT4分子用荧光量子点标记，比常规荧光染料更明亮且易于褪色，并使用实时共聚焦显微镜和EMCCD摄像头观察到。此外，通过通过2D高斯近似值近似荧光强度分布并获得顶点的坐标来确定GLUT4分子的位置。 GLUT4分子牢固地固定在基底状态下的肌肉结构，但由于胰岛素刺激而开始缓慢移动。此外，当在定期收缩的肌肉放松过程中跟踪GLUT4分子的坐标时，发现GLUT4分子的运动在不运动的肌肉中更加强烈。这是脂肪细胞中GLUT4分子中未发现的特征，这表明在肌肉和脂肪细胞中，GLUT4分子可以通过完全不同的机制实现膜易位。