RNA干渉法による慢性疼痛のメカニズム解明と遺伝子治療への応用

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目的 ラット後根神経節細胞の培養実験において,サイトカインシグナリングをターゲットに,siRNAをNucleofection法により遺伝子ノックダウンする事でラット後根神経節培養細胞におけるCOX-2,PGE2等の産生抑制を観察する。ラット後根神経節培養細胞にsiRNAを導入する実験(In Vitro)[ラット後根神経節培養細胞の単離]過去の文献通り(Fehrenbacher JC, et. al.Pain,2005),Sprague-Dawleyrat(150-200g)安楽死後,後根神経節を脊髄より取り出し,コラゲナーゼを含むHam'sF12培養液で2時間培養することにより細胞を単離した。PBSで洗浄後,NGFを含むpoly-D-IysineでコートされたHam's F12培養液で培養した。[siRNAの作成]NF-κBp50,IκBα kinase,p38MAPK,ERKをターゲットにしたsiRNA塩基配列作成した。[Nucleo fection法によるsiRNA導入,及び遺伝子発現抑制効果の確認]ラット後根神経節培養細胞を,Nucleofector solution内に2-5x10^6cells/100μ1に播種しsiRNA1.5μgを添付後,Amaxa siRNA nucleofection programに従いsiRNAの導入を行う。24時間又は48時間CO2インキュベーターにて培養後に細胞回収しノックダウンの効果を確認した。ラット後根神経節細胞におけるサイトカインシグナルノックダウンの効果IL1-β,TNF-αによりラット後根神経節培養細胞を刺激することにより,p38MAPKをノックダウンした群において,COX-2,iNOS,SubstancePの生成の抑制をELISA法等にて確認した。