低分子RNA生成におけるHsp90とAgoタンパク質の相互作用の重要性

Hsp90 和 Ago 蛋白之间相互作用在小 RNA 生产中的重要性

• 批准号: 24570136
• 负责人: 南 康文
• 金额: $ 3.58万
• 依托单位: Maebashi Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-24570136/
• 关键词: 分子シャペロン; 低分子RNA; 翻訳制御

本研究はドライ系(予測とウエット系(実験)の両方向から、RNAタンパク質複合体の活性型形成に分子シャペロンがどう関わるかを最小単位の機能ドメインレベルで突き詰めようとする斬新な試みである。先ずは、コンピューター・シミュレーションによるクライアント結合構造の探索手法の確立を目指して、分子動力学計算から求められた結合エネルギーとクライアントのAla置換部位との相関関係から結合インターフェース構造の推定が可能かどうかを検討した。具体的には、p21(cyclin-dependent kinase inhibitor)のAla置換による結合活性の変化からHuman PCNA(proliferating cell nuclear antigen)とp21の結台構造を特定しようと試みた実験(Nakanishi, M, et al.,J., Biol. Chem. 270 : 17060, 1995)を参照し、水溶媒中でのPCNAとp21(Ala置換したものも含めて)の結合エネルギーをMM-PBSA(Molecular Mechanic/Poisson-Boltzmann Surface Area)法及びMM-GBSA(MM/Generaｌized Born)法を用いて見積った。上記の2つの方法で見積られたAla置換による結合エネルギーの変化の傾向はほぼ一致したが、結合活性に関する実験結果を再現しなかった。また、推定誤差の範囲も大きかった。問題点として、設定したシミュレーション時間が小さかった点が挙げられる(今回はテストケースとして2ns)。更に長時間シミュレーション(20ns以上の)を可能とするため、GPUによる計算システムの構築が必要となる。次に、RNAタンパク質複合体と分子シャペロンに関しての詳細な結合情報を得るために、クライアントであるRNA結合タンパク質Agoと分子シャペロンであるHsp90、コシャペロンであるHop及びp23に関して欠失体作製を行ない、お互いの欠失体間の結合性を評価することによって、それぞれのタンパク質が持つ特異的な相互作用ドメインを明らかにすることができる。以上のような戦略から、AgoのN末側からとC末側からの欠失体の作製を検討した。AgoはN末ドメイン、L1ドメイン、PMドメイン、L2ドメイン、Midドメイン、PIWIドメインの6つから成る。発現系としてはCMVプロモータープラスミドを使用し、宿主系としてはHeLa細胞を用いた。結果として、N末ドメインを持つC末側からの欠失体は細胞内で安定に蓄積されたが、その逆のC末ドメインを持つN末側からの欠失体は、L2-Mid-PIWIドメイン以外では、大変不安定で蓄積されなかった。以上を総合すると、各種の機能ドメインの発現にはN末ドメインとの融合が有利であるように思われた。よって、更なるドメイン別の発現ではこのアイデアを用いることとしたい。今後更に、Agoの欠失体の場合と同様に、Hsp90やコシャペロン(Hop及びp23)の欠失体の作製について検討する必要がある。

In this study, we investigated the molecular structure and function of RNA protein complexes in the active form of RNA protein complexes. First of all, the method of exploring the binding structure of the compound is pointed out. The molecular dynamics calculation is carried out to find the correlation between the binding structure and the substitution site. Specific changes in the binding activity of p21(cyclin-dependent kinase inhibitor) and p21 (proliferating cell nuclear antigen) in the Ala substitution are described in detail (Nakanishi, M, et al., J., Biol. Chem. 270 : 17060, 1995), PCNA and p21(Ala substitution) in aqueous solution were synthesized by MM-PBSA(Molecular Mechanic/Poisson-Boltzmann Surface Area) and MM-GBSA(MM/Generalized Born) methods. The results of the above two methods are consistent with those of the previous methods. The estimated error range is large. The problem points and settings are set to a small number of times.(This time, the problem points and settings are set to 2ns.) For longer periods of time (20ns or more), it is necessary to construct a GPU computing system. The RNA binding complex and the molecular structure of the molecule are related to the detailed binding information. The RNA binding complex and the molecular structure of the molecule are related to the Hsp90 and p23. The binding between the RNA binding complex and the molecular structure of the molecule is evaluated. The interaction between the two groups is very specific. The above is a discussion on the operation of Ago's N end and C end. Ago has 6 different options: N terminal, L1 terminal, PM terminal, L2 terminal, Mid terminal, PIWI terminal The development system was developed using CMV as a host and HeLa cells as a host. The results showed that the N-terminal side of the cell was unstable and accumulated, and the N-terminal side of the cell was unstable and accumulated. The above is a combination of various functions, and the development of various functions is beneficial. The first is to change the color of the film and the second is to change the color of the film. In the future, Ago's failure situation is the same, Hsp90 and Hop (Hop and P23) and the failure of the operation of the necessary review.