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巨核球の増殖分化を担うトロンボポエチン受容体の活性化機構の分子構造基盤

负责巨核细胞增殖和分化的血小板生成素受体激活机制的分子结构基础

基本信息

批准号：
26293009
负责人：
黒木良太
金额：
$ 7.57万
依托单位：
Japan Atomic Energy Agency
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

H26年度は下記の2つの項目を実施した。1）Cys/Ala変異型TPOR(C/A-TPOR)の骨髄細胞への発現とTPOリガンドによる細胞増殖シグナルの確認細胞外領域に存在する遊離型Cys残基をAlaに置換したTPOR全長遺伝子(C/A-TPOR)を、骨髄由来の細胞株であるFDC-P2細胞に導入して発現させ、TPOリガンド濃度に対する細胞増殖を定量的に評価し、同じくFDC-P2細胞に発現させた野生型TPORに対するTPOによる細胞増殖を検討し、細胞応答におけるC/A-TPORと野生型TPORの同等性を確認することができた。本実験で用いたリガンドであるTPOは、大腸菌発現した試料をリフォールディング後、イオン交換クロマトグラフィーにて精製して用いた。2）HEK293細胞を用いたC/A-ecTPORの大量発現とリガンドカラムによる精製遊離型Cysを除去したTPORの細胞外領域(C/A-ecTPOR)の発現を、動物細胞(HEK293細胞)を用いて実施した。目的のC/A-ecTPORは、培養液中に主要な蛋白質として発現した。発現させたC/A-ecTPORを培養上清から精製するために、アフィニティークロマトグラフィー担体に結合させるリガンド候補を検討した。TPOそのもの、および数種類のTPORモノクローナル抗体を用いて精製の予備検討を行ったところ、いずれのリガンドも効果的に目的C/A-ecTPORを濃縮することができた。予備的な精製によって、C/A-ecTPORの精製にはTPORモノクローナル抗体カラムを用い、高い純度の試料を確保できた。

The next two projects will be implemented in H26. 1) Cys/Ala-typed TPOR (C/A-TPOR) osteoblastoma cells show that there are some Cys residues in the extracellular domain, such as TPOR full-length mutants (C/A-TPOR), skeletal genesis cells, FDC-P2 cells, and the presence of clones in extracellular domain. The results of TPO assay showed that the wild-type TPOR, wild-type TPO, wild-type TPOR, C/A-TPOR, wild-type TPOR, wild-type, wild-type and wild-type. In this system, you need to know how to use the TPO. After you see that the material is not used, you can communicate with each other. 2) the HEK293 cell uses a large number of C/A-ecTPOR cells to remove the extracellular domain (C/A-ecTPOR) of the TPOR cell, and the animal cell (HEK293 cell) to apply the product. Objective to detect the main protein in C/A-ecTPOR and culture solution. Now that the C/A-ecTPOR is ready, the supernatant is fine, and the supernatant is in good condition. In this way, the supernatant is in good condition. In the case of TPO, the number of TPOR antibodies, such as the number of samples, the number of TPOR antibodies, the number of antibodies. For the equipment, the precision, the C/A-ecTPOR, the TPOR, the antibody, the antibody, the high temperature, the antibody, the anti-virus, the antibody, and the high temperature.