巨核球の増殖分化を担うトロンボポエチン受容体の活性化機構の分子構造基盤

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H26年度は下記の2つの項目を実施した。1）Cys/Ala変異型TPOR(C/A-TPOR)の骨髄細胞への発現とTPOリガンドによる細胞増殖シグナルの確認細胞外領域に存在する遊離型Cys残基をAlaに置換したTPOR全長遺伝子(C/A-TPOR)を、骨髄由来の細胞株であるFDC-P2細胞に導入して発現させ、TPOリガンド濃度に対する細胞増殖を定量的に評価し、同じくFDC-P2細胞に発現させた野生型TPORに対するTPOによる細胞増殖を検討し、細胞応答におけるC/A-TPORと野生型TPORの同等性を確認することができた。本実験で用いたリガンドであるTPOは、大腸菌発現した試料をリフォールディング後、イオン交換クロマトグラフィーにて精製して用いた。2）HEK293細胞を用いたC/A-ecTPORの大量発現とリガンドカラムによる精製遊離型Cysを除去したTPORの細胞外領域(C/A-ecTPOR)の発現を、動物細胞(HEK293細胞)を用いて実施した。目的のC/A-ecTPORは、培養液中に主要な蛋白質として発現した。発現させたC/A-ecTPORを培養上清から精製するために、アフィニティークロマトグラフィー担体に結合させるリガンド候補を検討した。TPOそのもの、および数種類のTPORモノクローナル抗体を用いて精製の予備検討を行ったところ、いずれのリガンドも効果的に目的C/A-ecTPORを濃縮することができた。予備的な精製によって、C/A-ecTPORの精製にはTPORモノクローナル抗体カラムを用い、高い純度の試料を確保できた。