TRUEジーンサイレンシング法によるマイクロRNA制御による骨形成誘導法の開発

使用TRUE基因沉默方法开发利用microRNA控制的骨形成诱导方法

• 批准号: 20659288
• 负责人: 田村 正人
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659288/
• 关键词: TRUEジーンサイレンシング; 骨芽細胞; マイクロRNA; 骨形成; tRNaseZL; TRUジーンサイレンシング

昨年度までに同定した骨芽細胞分化に機能するmiRNAは,古典的WntシグナルもしくはBMP-2によって発現量が増加するmiRNAである.骨芽細胞の分化段階にけるこれらのmiRNAの発現量の変化を調べるために,MC3T3-E1細胞を4週間培養し,1週ごとに全RNAを回収した.このRNAを用いてStep-OneによるリアルタイムPCR法によって発現量の変動を定量化した.骨芽細胞の分化が進むにつれて,これらのmiRNAの発現量は増大した.またこれらのmiRNAをantagomiRもしくはsgRNAを用いてノックダウンした.リアルタイムPCR法でこれらのmiRNAがほぼ検出限界以下までノックダウンさせることに成功した.これらのノックダウンによって骨芽細胞分化に関連するmRNAの発現を調べたところ,オステオカルシンのmRNAは有意に減少しなかったが,アルカリフォスファターゼmRNAは著しく減少していた.以上の結果から,これらのmiRNAは,骨芽細胞分化に関連するmiRNAである可能性が高いと考えられた.そこで,これらのmiRNAの標的となるmRNAの候補を,データベースより検索した.さらに,TRUEジーンサイレンシング法を用いたmiRNA抑制性sgRNA発現プラスミドのライブラリーを未分化間葉系細胞培養系に導入し,アルカリフォスファターゼ活性染色やリアルタイムRT-PCR法を用いて,Runx2,osterix,I型コラーゲン,オステオカルシン,ALP,BSP,MEPE,MMP-13などのmRNAの発現量を測定した.これらより骨芽細胞分化と関連するmRNAが誘導されるsgRNAが見出された.これらのsgRNAの骨・軟骨形成に及ぼす影響及び内軟骨性骨形成に対する影響について検討を行った.sgRNA発現プラスミドもしくは2'-O-methyl化sgRNAの導入によって骨形成マーカーの増加が観察され,これらのsgRNAは骨形成活性を有している可能性が考えられた.

Yesterday's annual までに同定したbone bud cell differentiationにfunctionするmiRNAは,classical WntシグナルもしくはBMP-2によって発The differentiation stage of bone bud cells is the same as that of the current amount of miRNA. MC3T3-E1 cells were cultured for 4 weeks, and total RNA was recovered for 1 week. Step-One RNA was used for recovery.るリアルタイムPCR method によって発真人の変动をquantificationした. Bone bud cell differentiation がむにつれて, これらのmiRNAのThe amount of the present is increased. The amount of the RNA is increased. The amount of the RNA is increased.リアルタイムPCR methodでこれらのmiRNAがほぼ検below the limitまでノックダウンさせることにsuccessfulした.これらのノックダウンによってbone bud cell differentiation にrelated するmRNAの発appears をtone べたところ, オステオカルシンのmRNAは intentionalにREDUCED しなかったが, アルカリフォスファターゼmRNA は しく REDUCED していた. The above results から, これらのmiRN A, the possibility of osteoblast differentiation is high and the possibility of miRNA is high. The target of miRNA is high.なるmRNAの candidateを,データベースより検SOした.さらに,TRUEジーンサイレンシング法を用いたmiRNA Inhibitory sgRNA was introduced into the undifferentiated mesenchymal cell culture system, and the inhibitory sgRNA was introduced into the cell culture system. Sex staining やリアルタイムRT-PCR method is used for いて, Runx2, osterix, type I コラーゲン, オステオカルシン, ALP, BSP, MEPE, MMP-13 and its correlation with osteoblast differentiation and measurement of mRNA expression. Induction of mRNA and sgRNA's effects on bone and cartilage formation and endochondral bone shape成に対する Impact について検検行をった.sgRNA発行プラスミドもしくは2'-O-methylated sgRNAのImport によってbone forming マーカーのincrease が観看され, これらのsgRNA はbone forming activity を有している possibility が考えられた.

项目成果

ヒトBcl-2 mRNAを標的とする裸のRNA heptamerによるアポトーシスの誘導

裸露 RNA 七聚体靶向人 Bcl-2 mRNA 诱导细胞凋亡

• 发表时间: 2009
• 作者: Nakashima;A.;中島愛子;高橋昌幸
• 通讯作者: 高橋昌幸

Regulation of microRNA expression by bone morphogenetic protein-2

骨形态发生蛋白2对microRNA表达的调控

• 发表时间: 2010
• 期刊: Interface Oral Health Science 2009
• 作者: 瀬戸口大典;仲村将高;他;仲村将高 他;Masataka Nakamura et al;Tamura M;Sato M
• 通讯作者: Sato M

"naked" RNA heptamer induces apoptosis by targeting the human Bcl-2 mRNA.

“裸”RNA 七聚体通过靶向人 Bcl-2 mRNA 诱导细胞凋亡。

• 发表时间: 2010
• 作者: 瀬戸口大典;仲村将高;他;仲村将高 他;Masataka Nakamura et al;Tamura M;Sato M;Tamura M;Sato M;Elbarbary RA;Sato M;Takahashi N
• 通讯作者: Takahashi N

Regulation of miR-206 expression by bone morphogenetic protein-2 through post-transcriptional microRNA maturation in mvoblastic C2C12 cells

成纤维细胞 C2C12 细胞中骨形态发生蛋白 2 通过转录后 microRNA 成熟调节 miR-206 表达

• 发表时间: 2009
• 作者: 瀬戸口大典;仲村将高;他;仲村将高 他;Masataka Nakamura et al;Tamura M;Sato M;Tamura M;Sato M;Elbarbary RA;Sato M;Takahashi N;高橋昌幸;Sato M
• 通讯作者: Sato M

Role of the Wnt signaling pathway in bone and tooth.

• DOI: 10.2741/e201
• 发表时间: 2010-06
• 期刊: Frontiers in bioscience
• 作者: M. Tamura;E. Nemoto;Mari Sato;Aiko Nakashima;H. Shimauchi