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sgRNAを用いた新規骨形成誘導法の開発

开发利用 sgRNA 诱导骨形成的新方法

基本信息

批准号：
18659547
负责人：
田村正人
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659547/
关键词：
tRNaseZ 骨形成骨芽細胞 sgRNA tRNaseZL

项目摘要

標的GSK-3β mRNAについて,切断予定部位の塩基配列の解析から5'-half-tRNA型(sgGSKH)及び数種のlinear型(sgGSKL)のsgRNAを設計した.293細胞及びC2C12細胞のGSK-3βは2'-O-メチル修飾したsgGSKHもしくはsgGSKLの導入によって著しく減少した.これらの結果は,sgRNAとtRNaseZLによって標的であるGSK-3β mRNAを有効に切断しノックダウンしたと考えられた.また,培養系においてfluorescein標識したsgGSKLは,リポフェクタミンを使用せず単独で添加しても細胞内に有効に取り込まれることが明らかになった.これらのsgGSKLをマウス頭蓋骨に単独で注入したところ,2週後の骨は有意に増加した.また,このsgGSKLの有効性について,マウス大腿骨骨折モデルを用いて内軟骨性骨形成に対する影響を検討した.マウス大腿骨を骨折させ,仮骨形成する時期に2'-O-メチル修飾したsgGSKLをelectrophorationにより導入した.3日後,1週間後,2週間後における骨折治癒の経過を単純エックス線装置で観察したが,骨折治癒に対する影響は観察されなかった.hydrodynamics gene transfer法を用いて,この2'-O-メチルsgGSKL RNAを全身投与し全身の骨量の検討を行ったが,この投与法では有意な変化が認められなかった.sgRNAの投与方法,投与量等の検討が必要ではあるが,新たな骨・軟骨組織の形成誘導法としての可能性を示唆する成果が得られた.

The target GSK-3β mRNA was cut off at a predetermined site, and the nucleotide alignment was analyzed from 5'-half-tRNA type (sgGSKH) to several linear type (sgGSKL) sgRNA designs. GSK-3β was modified by 2'-O-tRNA in 293 cells and C2C12 cells. As a result,sgRNA and tRNase ZL have been identified as GSK-3β mRNA. In addition, the culture system contains fluorescein labeling, sgGSKL, and the use of a single additive in the intracellular system. SgSKL was injected into the skull, and the bone was intentionally increased after 2 weeks. To investigate the effects of sGSKL on cartilage bone formation in femoral fractures. 3 days later, 1 week later, 2 weeks later, the fracture healing process was investigated by pure line device, and the effect of fracture healing was investigated by hydrodynamics gene transfer method. The 2'-O-modified sgGSKL RNA was injected into the whole body and the whole body bone mass was investigated. The method and amount of sgRNA administration were discussed, and the possibility of inducing new bone and cartilage tissue formation was demonstrated.