レセプター・リガンド相互作用の解析と甘味受容機構の解明

受体-配体相互作用分析及甜味受体机制阐明

基本信息

批准号：
09J02617
负责人：
伊藤圭祐
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2011
项目状态：
已结题

项目摘要

酸味を甘味へ変換する味覚修飾タンパク質,ミラクリンは、酸によって甘味レセプターのon/offを変化させる分子スイッチと捉えることが出来る。すなわち、ミラクリンの味覚修飾機構=甘味レセプターのスイッチング機構の解明は、未だ不明な甘味受容機構解明への重要な手がかりとなり得る。本研究では構造生物学的手法と電気生理学的手法とを融合し、ミラクリンをモデル分子とした甘味レセプター・リガンド相互作用の解析により甘味受容機構を解明することを目的としている。研究初年度である今年度は、ミラクリンの構造機能相関解析を目的として研究をおこなった。まず初めに酵母発現系およびGFPを利用したハイスルーブット変異体タンパク質解析法を開発し、構造機能相関解析への基盤とした。並行して、ミラクリンの酵母発現系を構築した。我々は既に麹菌を宿主としたミラクリン発現系を構築しているが(Ito K.et al.Biochem Biophys Res Commun 2007)、酵母発現系はハイスループットな解析に有利である。精製後の酵母組み替えミラクリンは味覚修飾活性を示さなかったが、糖鎖の除去により活性の回復がみられた。変異体解析により、ミラクリンのAsn42に巨大な糖鎖が付加していることを明らかとし、この糖鎖が甘味受容体とミラクリンとの相互作用をブロックすることを示唆した。立体構造解析には糖鎖付加の無いミラクリンタンパク質を調製する必要がある。そこで構築した変異体解析法を応用し、タンパク質の分泌性バリアントの新規スクリーニング法を開発した。本法により糖鎖付加の無いミラクリン変異体の作出に成功した。現在、作出したバリアントを用い、X線結晶構造解析を進めている。

奇迹蛋白是一种转化酸度为甜度的味觉改良蛋白，可以看作是一种分子开关，它通过酸会改变甜度受体的开/关。换句话说，阐明奇迹素味道修饰机制的切换机制=甜味受体可能是阐明仍然未知的甜味受体机制的重要线索。这项研究旨在通过融合结构生物学方法和电生理方法来阐明甜味的接受机制，并通过使用奇迹素作为模型分子来分析甜味味道受体 - 配体的相互作用。今年是研究的第一年，我们进行了研究，目的是分析奇迹素的结构功能相关性。首先，开发了使用酵母表达系统和GFP的高直接对接突变蛋白分析方法，并用作结构和功能相关分析的基础。同时，构建了奇迹蛋白的酵母表达系统。尽管我们已经使用Koji Mold构建了一个奇迹素表达系统（Ito K.等人Biochem Biophys Res Commun 2007），但酵母表达系统对于高通量分析是有利的。纯化后的酵母重组奇迹蛋白没有显示味道改良活性，但是通过去除糖链来恢复活性。突变分析表明，将巨型聚糖添加到奇迹蛋白的ASN42中，这表明该聚糖阻断了甜味受体和奇迹素之间的相互作用。对于空间结构分析，有必要制备没有糖基化的奇迹素蛋白。使用那里构建的突变分析方法，我们为蛋白质的分泌变体开发了一种新颖的筛选方法。该方法成功地产生了没有糖基化的奇迹素突变体。当前，正在使用我们创建的变体进行X射线晶体结构分析。