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原核生物小分子RNAを利用した遺伝子ノックダウン系の構築

利用原核小RNA构建基因敲除系统

基本信息

批准号：
21657032
负责人：
饗場弘二
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Suzuka University of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

小分子RNA(sRNA)による転写後の遺伝子発現調節機構が大腸菌からヒトに至る多くの生物において発見され、細胞の環境応答や発生、分化などを支配している。大腸菌のグルコーストランスポーター遺伝子(ptsG)の発現が解糖系中間代謝産物の蓄積により転写後段階で抑制されるという発見を契機に一連の研究を展開し、この制御に関わるSgrS RNAがsRNAの作動原理の理解にとって有力であることを明らかにしてきた。本研究では、SgrSをモデル系として、原核生物におけるsRNAによる人為的遺伝子ノックダウン系の構築を目指す。平成22年度までに以下の成果を得た。1)SgrSは全長が227ntからなるRNA分子であるが、168-227領域からなる60ntのSgrS-Sが完全な活性を示すことを明らかにした。2)塩基対形成に必要な最小の領域は168-181の14ntであること、したがって、転写終結領域を含む182-227にHfqとの結合領域が存在することを明らかにした。3)実際に、転写終結シグナルの1つの要素であるpolyU tailがHfq結合部位であることを発見した。4)SgrS-Sの塩基対形成領域内に種々のmRNAの翻訳開始領域と相補的な30ntをクローニングし、IPTGにより発現誘導できる一連のを組換SgrSを構築し、標的mRNAの発現をNorthern blotting、およびWestern blottingにより解析したところ、いずれも効果的な抑制作用がみられた。すなわち人為的遺伝子ノックダウン系の構築に成功した。

Small RNA(sRNA) gene expression regulatory mechanisms after gene transcription from Escherichia coli to many organisms in the development, cell environment response, development, differentiation and control. The development of ptsG in E. coli and the accumulation of intermediate metabolites of glycophytolysis system were studied. The inhibition of ptsG in E. coli and the understanding of the mechanism of action of SgrS RNA were studied. In this study, we investigated the construction of the SgrS gene system in prokaryotes. The following results were achieved in 2012. 1)SgrS is 227nt in length and 60nt in SgrS-S is fully active in the 168-227 domain. 2) The minimum field necessary for the formation of the base pair is 168-181 and 14nt, and the final field is 182-227 and Hfq and the combined field exists. 3) In fact, the end of writing is the first element of the polyU tail Hfq binding site. 4)SgrS-S gene pair formation domain, mRNA translation initiation domain, complementary domain, IPTG induction domain, sequential SgrS-S gene construction domain, target mRNA expression domain, Northern blotting domain, Western blotting domain, analysis domain, and fruit inhibition domain. The construction of the man-made heritage system has been successfully completed.