染色体遺伝子へ影響を与えない全く新しい遺伝子操作マウス創出技術の確立

本年度は、rSeVを用いた遺伝子操作マウス構築を主として検討した。1)使用するベクターシステムの最適化以下の3種のベクターに対し、rSeVを用いた遺伝子操作マウスの構築を試みた。(1)ts-rSeV/dF(温度感受性変異挿入+F遺伝子欠損型ベクター:ベクター構築時に32℃にてM/HN遺伝子が発現し、体温に近い37℃にてM/HN遺伝子発現が著減する)(2)rSeV/dFdMdHN(ウイルス膜を構成する膜蛋白遺伝子全てを欠損する)(3)薬剤耐性遺伝子によるマウス構築効率の最適化薬剤耐性遺伝子(neomycin^r、puromycin N-acetyltransferase (Pac))を持つベクター(ts-rSeV/dFneo、rSeV/dFdMdHNneo、ts-rSeV/dFpac、rSeV/dFdMdHNpac)。いずれにおいてES細胞への高効率遺伝子導入、遺伝子発現細胞の多能性について維持されていることを確認した。2)RNAヘリカーゼノックダウンベクターの構築これまでの検討ではRIG-Iのdominant-negative変異体(RIG-IC)をrSeVにて発現させることにより個体発生まで至ることを見出した。このRIG-ICの必要性について、特に長期生存時における表現型の修飾について検討を進めた。

本年度は、rSeVを用いた遺伝子操作マウス構築を主として検討した。1)使用するベクターシステムの最適化以下の3種のベクターに対し、rSeVを用いた遺伝子操作マウスの構築を試みた。(1)ts-rSeV/dF(温度感受性変異挿入+F遺伝子欠損型ベクター:ベクター構築時に32℃にてM/HN遺伝子が発現し、体温に近い37℃にてM/HN遺伝子発現が著減する)(2)rSeV/dFdMdHN(ウイルス膜を構成する膜蛋白遺伝子全てを欠損する)(3)薬剤耐性遺伝子によるマウス構築効率の最適化薬剤耐性遺伝子(neomycin^r、puromycin N-acetyltransferase (Pac))を持つベクター(ts-rSeV/dFneo、rSeV/dFdMdHNneo、ts-rSeV/dFpac、rSeV/dFdMdHNpac)。いずれにおいてES細胞への高効率遺伝子導入、遺伝子発現細胞の多能性について維持されていることを確認した。2)RNAヘリカーゼノックダウンベクターの構築これまでの検討ではRIG-Iのdominant-negative変異体(RIG-IC)をrSeVにて発現させることにより個体発生まで至ることを見出した。このRIG-ICの必要性について、特に長期生存時における表現型の修飾について検討を進めた。