ヒト間葉系幹細胞からの肝細胞様細胞の作成と薬物動態毒性学的評価研究

利用人间充质干细胞创建肝细胞样细胞以及药代动力学和毒理学评价研究

基本信息

批准号：
22659031
负责人：
横井毅
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22659031/
关键词：
ヒト間葉系幹細胞ヒトアルブミン CYP3A4酵素活性分化誘導

项目摘要

【目的】本研究では市販のヒト間葉系幹細胞からヒト肝細胞を作成し、動態および安全性のin vitro試験への適用を目指して研究を行った。これまで、個々の患者から提供された骨髄またはiPS細胞からヒト肝臓様細胞の確立について、不完全ではあるが、報告がなされている。iPS細胞の使用には手技などの様々なハードルがあるが、ヒト間葉系幹細胞の分化は、比較的手技が易しく、患者試料から効率よく肝細胞が作成できることを示唆する報告がある。そこで本研究では、市販のヒト間葉系幹細胞から均一でin vitroスクリーニングに供することができる低コストで安定的な肝細胞への細胞分化系の確立を目指して研究を行った。【方法】材料はタカラバイオのhMSCヒト間葉系幹細胞を用いた。様々な分化系の条件を検討し、顕微鏡下での細胞像、肝細胞としてのマーカーであるヒトアルブミンの産生能および薬物代謝酵素であるチトクロムP450のmRNAの発現を主な指標とした。さらに、ヒトモノサイト由来のTHP-1細胞を肝細胞以外の標準細胞として用いた。【結果および考察】増殖については、専用のMSCGMで培養することで、充分な増殖が得られた。分化過程は、繊維芽細胞増殖因子であるFGF1およびFGF4,肝細胞増殖因子HGFの存在下で14日間の培養で判断を行った。基本培地条件はHCMで行った。成熟過程は、オンコスタチンM(OsM)とデキサメタゾン(Dex)の標準法で行った。その結果、FGF1,FGF4およびHGFの濃度と処理日数を様々に変化させても、分化の兆候は得られなかった。患者由来の新鮮試料を使用した場合には、分化誘導の兆候は、3日目頃に形態変化として認めることができるが、市販のhMSCではCD105の陽性が検出できなかったこと、CYPの発現も認められなかったことなどから、分化誘導が困難であった。次に、骨髄ではなく、脂肪細胞由来の間葉系幹細胞を用いて、さらに様々な検討を行った。その結果、アクチビンAとFGF4で3日間培養後、HGF,FGF1,FGF4,OsM,Dexおよびニコチンアミドを全て同時に入れて10日から14日間で肝細胞様細胞への形態変化が認められ、ヒトCYP3A4、アルブミン産生も得られた為に、一定の成功を治めた。しかし、ヒト肝に比べて発現量が低い為にさらなる検討を継続している。

目的：在这项研究中，人类肝细胞是由市售人的间充质干细胞创建的，并进行了研究，目的是将其动力学和安全性应用于体外研究。以前，尽管已经做出了报告，尽管并非完全是由单个患者提供的骨髓或IPS细胞的人肝样细胞。尽管使用IPS细胞（例如技术）有各种障碍，但有报道称，人间充质干细胞的分化相对易于使用，并且可以从患者样品中有效地产生肝细胞。因此，在这项研究中，我们进行了研究，旨在将细胞分化系统建立到低成本，稳定的肝细胞中，该系统可以均匀地受到从市售人类间充质干细胞中进行体外筛查。方法：该材料是来自Takara Bio的HMSC人间充质干细胞。检查了各种分化系统的条件，主要指标是显微镜下的细胞图像，产生人白蛋白的能力，标记为肝细胞的标志物以及细胞色素P450的mRNA的表达，一种药物 - 代谢酶。此外，除了肝细胞以外，使用源自人单核细胞的THP-1细胞用作标准细胞。 [结果和讨论]通过使用专门的MSCGM培养它可以实现足够的增长。在成纤维细胞生长因子FGF1和FGF4以及肝细胞生长因子HGF的情况下，通过培养方法确定了14天的分化过程。使用HCM进行了基本培养基。使用OnCostatin M（OSM）和地塞米松（DEX）的标准方法进行成熟过程。结果，即使在不同的FGF1，FGF4和HGF和治疗日的浓度变化时，也没有获得分化的迹象。当使用患者的新鲜样品时，可以将分化诱导的迹象视为第三天左右的形态变化，但是市售的HMSC无法检测到阳性CD105，并且未观察到CYP表达，因此很难诱导分化。接下来，使用源自脂肪细胞而不是骨髓的间充质干细胞进行了各种进一步的研究。结果，在与Activin A和FGF4孵育3天后，同时添加了HGF，FGF1，FGF4，OSM，DEX和Nicotinamide，并同时添加了肝细胞状细胞的形态变化，在10至14天内观察到了人类CYP3A4和白蛋白产生，从而在某些人的CYP3A4和白蛋白中产生了一定程度。但是，由于表达水平低于人类肝脏的进一步研究。

项目成果

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会议论文数量（0）

专利数量（0）

Rogulation of human cytochrome P450s and nuclear receptors by micro RNAs.

Micro RNA 对人细胞色素 P450 和核受体的调节。

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
Kazumasa Matsuo;et al;横井毅
通讯作者：
横井毅

薬物性肝障害の予測試験系とバイオマーカー

药物性肝损伤的预测测试系统和生物标志物

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
Oda;T.;Kume;T.;Izumi;Y.;Ishihara;K.;Sugimoto;H.;Akaike;A.;横井毅
通讯作者：
横井毅

代謝物を考慮した薬物誘導性肝障害の予測試験系の検討

考虑代谢物的药物性肝损伤预测测试系统的检查

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
Osawa Y;Seki E;Kodama Y;Suetsugu A;Miura K;Adachi M;Ito H;Shiratori Y;Banno Y;Olefsky JM;Nagaki M;Moriwaki H;Brenner DA;Seishima M;横井毅
通讯作者：
横井毅

Stimulation of pro-inflammatory responses by mebendazole in human monocytic THP-1 cells through an ERK signaling pathwey.

甲苯咪唑通过 ERK 信号通路刺激人单核 THP-1 细胞中的促炎反应。

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
Archives of Toxicology
影响因子：
6.1
作者：
Katsuhiko Mizuno;et al.
通讯作者：
et al.

Approaches to predict idiysyncratic and immune-mediated drug-induced liver injury.

预测异质性和免疫介导的药物性肝损伤的方法。

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
Cho HS;Toyokawa G;Daigo Y;Hayami S;Masuda K;Ikawa N;Yamane Y;Maejima K;Tsunoda T;Field HI;Kelly JD;Neal DE;Ponder BA;Maehara Y;Nakamura Y;Hamamoto R;横井毅
通讯作者：
横井毅