チトクロ-ムPー450の新しい生理的意義に関する研究ー内因性生理活性ペプチドの調節における役割ー

细胞色素P-450的新生理意义研究 - 调节内源性生理活性肽的作用 -

基本信息

批准号：
03807144
负责人：
横井毅
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

チトクロ-ムPー450(以下Pー450)の生体内での多様な機能の一つとして、蛋白から生理活性ペプチドへのプロセッシングの過程で関与するという仮説の基に研究を行なった。すなわち、Pー450関与のラジカル的酸化が第一ステップとなり、続いて酸化部分を目印として、プロテア-ゼ・ペプチダ-ゼが作用し、ポリペプチドの切断が起きるという可能性について検討した。生体内ポリペプチドはアルギニンまたはロイシン部分で特異的に切断される場合が多いことが知られている。本研究ではメチオニンーエンケファリン(MetーEn)、ロイシンーエンケファリン(LeuーEn)の両側2〜3アミノ酸を延長させた前駆体ポリペプチドを3種類(LeuーEn;9アミノ酸長,MetーEn;9と10アミノ酸長)合成した。これらは、アルギニン部分が認識・切断されるとエンケファリン(En)になり、生体内では主に副腎で反応が行なわれる。合成したペプチドはHPLCで精製後、アミノ酸分析で純度が95%以上であることを確認して実験に供した。牛副腎のミクロゾ-ム(Ms)や9000×g上清を用い、種々のin vitroの反応条件を検討した。分析はメタノ-ル抽出後、HPLC(capcel pack C_<18>カラム、移動相;50mMnNaH_2PO_4:アセトニトリル=88:12)を用いる方法が最適であった。内部標準は市販MetーEn,LeuーEnを用いた。in vitroでの反応の結果、MsではNADPH精製系の有無にかかわらず、Msに依存した切断(代謝)は認められなかった。一方、9000×g上清単独のみでペプチドの切断が認められた。ヒト肝Msや9000×g上清を用いた系でも、牛副腎での結果と同じであった。また、鉄イオンやアスコルビン酸の影響など、生体内の酸化還元状態を考慮した系でも検討したが、明確な結果は得られなかった。しかし、9000×g上清での代謝反応はMetーEn,LeuーEnからさらに断片化反応が容易に進行することから、in vivoでのEn産生とは異なる機構であると考えられた。前駆体ペプチドから特異的にEnを産生するための限定分解の機構は9000×g上清成分の関与とは別の機構が存在することが示唆された。今後、よりin vivoに近い実験系で詳細に検討を行なう必要があると思われる。

研究是基于以下假设进行的：细胞色素P-450（以下称为P-450）参与了从蛋白质到生理活性肽的加工过程，这是体内各种功能之一。换句话说，P-450涉及的自由基氧化是第一步，然后使用氧化部分作为标记，蛋白酶肽酶起作用和多肽的裂解的可能性。众所周知，体内多肽通常被精氨酸或亮氨酸部分特异性裂解。在这项研究中，合成了三种类型的前体多肽（Leu-en； 9个氨基酸长度，Met-EN； 9和10氨基酸长度），在蛋氨酸 - 源石源性和亮氨酸 - 源自酮磷脂的两侧延伸了2至3个氨基酸。当精氨酸部分被识别和裂解时，这些部分变成enkephalin（EN），在体内，反应主要由肾上腺进行。通过HPLC纯化合成的肽，然后通过氨基酸分析确认其纯度为95％或更多，并进行了实验。使用牛肾上腺微粒体（MS）和9000×G上清液研究了各种体外反应条件。最佳分析是在提取甲醇后使用HPLC（Capcel Pack C_ <18>列，流动相； 50 mm NNAH_2PO_4：乙腈= 88：12）。内部标准是商业上可用的EN和LEU-EN。由于体外反应，MS中未观察到MS依赖性裂解（代谢），无论是否存在NADPH纯化系统。另一方面，只有9000×g上清液观察到肽的切割。结果与使用人肝MS和9000×G上清液中的牛肾上腺中的结果相同。此外，尽管还考虑了系统中的氧化态，例如铁离子和抗坏血酸的作用，但仍未获得明确的结果。然而，随着片段化反应从met-en和leu-en中更容易发展，上清液中9000×g上清液的代谢反应被认为是一种不同的机制。有人提出，特异性产生从前体肽的EN的降解的机理与9000×G上清液组件的参与不同。看来，将来有必要在更接近体内的实验系统中进行详细的检查。