ゲノム機能解析による鳥類血液原虫の感染制御へ向けた基盤研究

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本年度は原虫遺伝子の転写解析および遺伝子導入法を検討するために、鳥マラリア原虫(Plasmodium gallinaceum)のin vitro培養法、継代維持法を検討した。はじめに、P. gallinaceumを感染させたニワトリの血液を用いて、赤内型および赤外型虫体のin vitro培養条件を検討した。赤内型虫体の培養はヒトのマラリア原虫と同様の複数の条件下で行い、培養後3日目までは原虫の生存性が顕微鏡下で観察できたが、4日目以後に生存する原虫数は顕著に減少した。赤外型虫体の培養は、原虫の宿主細胞となる鶏胚繊維芽細胞(CEF)を継代培養し、原虫の細胞への侵入と増殖の様子を確認し、安定した赤外型虫体の継代維持法を確立する予定である。次いで発育鶏卵を用いた原虫の培養条件を検討した。10日齢の発育鶏卵の漿尿膜腔、羊膜腔および静脈内に原虫感染血液を接種後7日目に鶏胚の感染状態を確認した。その結果、漿尿膜腔および羊膜腔では原虫の発育は認められなかったが、静脈内に接種後は発育が認められ、赤血球における原虫寄生率は70～99%であった。原虫が発育した鶏胚から採取した血液を、10日齢の発育鶏卵の静脈内に再度接種したところ、接種後7日目には原虫の発育が認められ、血液ステージの原虫を継代培養が可能であることが示唆された。さらに、上記培養法で維持された原虫の発育環を完成させるために、ベクター(蚊)を介した原虫維持法を検討した。用意した17日齢鶏卵の気室部卵殻を除去し、卵殻膜を介して蚊が吸血できる環境を整えたところ、複数の蚊が鶏卵を吸血していた。今後は原虫に感染した17日齢鶏卵を用いて蚊に吸血させ、蚊体内での原虫の発育および鶏卵への感染能の有無を検討することが可能となるだろう。さらに、培養した原虫へ遺伝子を導入するためには、各発育ステージの原虫を分離精製する必要がある。鶏卵培養で得られた原虫感染血液を用いて密度勾配遠心を行い、シゾント期の虫体を40%含む分画を得ることができた。