脊椎動物におけるマイクロペプチドの探索と分子機能の解析

脊椎动物中微肽的搜索和分子功能分析

• 批准号: 25440109
• 负责人: 深見 泰夫
• 金额: $ 3.24万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-25440109/
• 关键词: マイクロペプチド; アフリカツメガエル; 質量分析

昆虫や植物では１０～数１０アミノ酸残基のマイクロペプチドと呼ばれる小さいペプチドが個体発生や形態形成において重要な働きをしている事が知られているが、同様な機能を持ったマイクロペプチドが脊椎動物にも存在するかどうかは明らかになっていない。そこで、脊椎動物におけるマイクロペプチドの存在を明らかにするため、アフリカツメガエル卵抽出液よりマイクロペプチドを含むと思われる短鎖ペプチド群を単離する事を試みた。アフリカツメガエルの卵は、通常の動物組織や細胞と異なり、細胞質が非常に大きく遠心操作によって容易に素早く破砕できるので、大量の細胞質因子をタンパク質分解酵素による分解を最小限に抑えた状態で得る事ができるという利点がある。アフリカツメガエル卵を遠心によって破砕して得た疎抽出液から超遠心法によって細胞質分画を調製し、さらに熱処理によって変性するタンパク質を除いた上澄を限外濾過膜で３分画（分子量１０万以上、１０万～１万、１万～３千）に分画したものを、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。その結果、分子量３千～１万の分画に、クマシー染色や銀染色されるペプチドと思われる数多くのバンドを認めた。これらのペプチドバンドを質量分析機により解析した所、いくつかのペプチドは大きなタンパク質の分解産物であったが、その他のほとんどのペプチドは用意したmRNA配列情報（EST Database）からは同定できなかった。この理由としては、用意したEST Databaseが通常の１００アミノ酸以上のオープンリーディングフレームを持つものであったことが考えられ、今後はより短いオープンリーディングフレームに対応するEST Databaseを用意する必要がある。また、さらに十分な量のペプチドを調製し、MS/MS解析により内部アミノ酸配列を明らかにしていく必要がある。

Insects や plants で は number 10 to 10 ア ミ ノ acid residues の マ イ ク ロ ペ プ チ ド と shout ば れ る small さ い ペ プ チ ド が individuals born 発 や morphogenetic に お い て important な 働 き を し て い る matter が know ら れ て い る が, with others in function of な を hold っ た マ イ ク ロ ペ プ チ ド が vertebrate に も exist す る か ど う か は Ming ら か に な っ て い な い. そ こ で, vertebrate に お け る マ イ ク ロ ペ プ チ ド の is を Ming ら か に す る た め, ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル eggs extract よ り マ イ ク ロ ペ プ チ ド を containing む と think わ れ る short lock ペ プ チ ド group を 単 from す る matter を try み た. ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル は の eggs, usually の animal tissue cells や と different な り, cytoplasm が very に き く telecentric operation に よ っ て easily に element early く 砕 で き る の で, massive の cytoplasmic factors を タ ン パ ク qualitative decomposition enzyme に よ る decomposition を minimum に え suppression た state で る is が で き る と い う tartness が あ る. ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル eggs を telecentric に よ っ て broken 砕 し て have た 疎 extract か ら buzzer-beaters art に よ っ て cytoplasm painting を し modulation, さ ら に hot 処 Richard に よ っ て - sex す る タ ン パ ク qualitative を except い た dearing を limit on filtration membrane で three points outside painting (molecular weight more than 100000, 100000 ~ 10000, 10000 ~ 3000) に points draw し た も の を, SDS - ポ リ Youdaoplaceholder0, リ, ア, ア, ドゲ, によ, electric movement によ,, analysis, た. そ の results, molecular weight 3000 ~ 10000 の painting に, ク マ シ ー dyeing や silver さ れ る ペ プ チ ド と think わ れ る more く の バ ン ド を recognize め た. こ れ ら の ペ プ チ ド バ ン ド を quality analysis machine に よ り parsing し た, い く つ か の ペ プ チ ド は big き な タ ン パ ク qualitative の decomposition product で あ っ た が, そ の he の ほ と ん ど の ペ プ チ ド は intention し た mRNA with column intelligence (EST Database) か ら は with fixed で き な か っ た. こ の reason と し て は, meaning し た EST Database が usually の 100 ア ミ ノ acid above の オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム を hold つ も の で あ っ た こ と が exam え ら れ, future は よ り short い オ ー プ ン リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム に 応 seaborne す る EST Database を intention す る necessary が あ る. ま た, さ ら に very な quantity の ペ プ チ ド を modulation し, MS/MS analytical に よ り internal ア ミ ノ acid with column を Ming ら か に し て い く necessary が あ る.