動物細胞内シグナル伝達におけるカルシウム応答性アダプタータンパク質の機能解析

钙反应接头蛋白在动物细胞内信号转导中的功能分析

基本信息

批准号：
14J09452
负责人：
京卓志
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J09452/
关键词：
タンパク質間相互作用カルシウム結合タンパク質小胞輸送

项目摘要

申請書にって、カルシウム結合タンパク質ALG-2とTFGの相互作用が初期分泌経路において果たす役割を検討した。昨年度までに、ALG-2の過剰発現によってTFGのERES局在が顕著になる結果が得られており、その効果とERストレス及びTFG発現量との関連を調べた。まず、ALG-2の過剰発現によって、ERストレスが惹起されるかを調べるために、ALG-2を過剰発現させた細胞のERストレスマーカーの発現量を調べた。ALG-2の過剰発現によってERストレスマーカーの発現が増加しなかったことから、ALG-2の過剰発現とERストレスとの関連は見出されなかった。次に、ALG-2過剰発現細胞におけるTFGの発現量をウエスタンブロッィングで調べた。しかし、ALG-2を過剰発現した細胞と過剰発現していない細胞間で、TFGの量の差はみられなかった。以上の結果から、TFGの局在に対するALG-2過剰発現の効果は、ERストレス及び、TFGの発現量の変化とは独立していることが考えられた。続いて、TFGのさらなる機能解明に向けて、TFGの新規相互作用タンパク質の探索を行った。その結果、TFGの新規相互作用タンパク質候補としてTRAF3を同定した。GFP-TFGとHA-TRAF3を共発現させたHEK293細胞から溶解液を調製し、抗GFP抗体による免疫沈降を行った結果、HA-TRAF3が共沈降した。このことから、TRAF3はTFGと相互作用することが確認された。さらに、免疫染色を行った結果、ゴルジ体様の局在パターンである核の周囲において、GFP-TFGの蛍光シグナルとHA-TRAF3の免疫染色シグナルが部分的に一致した。以上の結果から、初期分泌経路においてTFGとTRAF3の相互作用が何らかの役割を果たす可能性が示唆された。

该应用研究了钙结合蛋白ALG-2和TFG在早期分泌途径中发挥作用的作用。截至去年，ALG-2的过表达导致了TFG定位的显着定位，并研究了其效应与ER应力与TFG表达水平之间的关联。首先，为了研究ALG-2过表达引起的ER应力，检查了过表达ALG-2的细胞中ER应力标记的表达水平。由于ALG-2过表达不会增加ER应力标记物的表达，因此ALG-2过表达与ER应力之间没有发现任何关联。接下来，通过Western Bluffing检查了ALG-2过表达细胞中TFG的表达水平。但是，在过表达ALG-2的细胞和未表达过表达的细胞之间没有观察到TFG量的差异。从上述结果中可以认为，ALG-2过表达对TFG定位的影响独立于ER应力和TFG表达水平的变化。接下来，我们搜索了TFG的新型相互作用蛋白，以进一步阐明TFG的功能。结果，TRAF3被确定为TFG的新型相互作用蛋白质候选者。由共表达GFP-TFG和HA-TRAF3的HEK293细胞制备裂解液，并使用抗GFP抗体进行免疫沉淀，从而导致HA-TRAF3共沉淀。这证实了TRAF3与TFG相互作用。此外，免疫染色表明，HA-TRAF3的GFP-TFG和免疫染色信号的荧光信号在细胞核周围是部分一致的，这是一种类似高尔基体的定位模式。以上结果表明，TFG和TRAF3之间的相互作用可能在早期分泌途径中起作用。