超解像イメージングによるミトコンドリア外膜透過性上昇機構の研究

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まずは、前年度の「ミトコンドリアに酸化ストレスを負荷すると内膜と外膜が解離すること」を踏まえて内膜と外膜の解離にどのようなタンパク質が関与しているかを調べた。前年度の終盤に検討したミトコンドリアマトリクスタンパクCypDの影響を調べた。細胞膜に薬剤処理を行い、穏やかに細胞外へ取り出したミトコンドリアに対して、CellMask Greenで外膜を標識し、MitoTracker Redで内膜を標識した。このようなミトコンドリアに酸化ストレスを負荷すると、約半数のミトコンドリアにおいて内膜と外膜の解離が見られたが、CypD阻害剤であるCsAを処理するとその数は有意に減少した。このことから、ミトコンドリアの内膜と外膜の解離にCypDが関与していることが考えられる。続いて、ミトコンドリア内膜の透過性上昇を起こすようなダメージにおいて、ミトコンドリアの膜構造はどのように変化するかを調べた。前年度ミトコンドリアに高濃度カルシウムを負荷すると、内膜透過性上昇が起こることを示した。そこで、単離ミトコンドリアに高濃度カルシウムを負荷すると内膜と外膜の解離は見られず、シグナルが少し大きくなったように観察された。これは内膜透過性上昇が起きて、外膜が破裂している途中であることを示唆している。最後に、ミトコンドリア外膜タンパク質であるTom20に蛍光タンパク質mCherryを融合させたTom20-mCherryとmito-GFP（ミトコンドリア移行シグナルを持つGFPベクター）を発現させた細胞を作成し、酸化ストレスを負荷した実験を行った。生細胞での観察ではミトコンドリアの動きがあることや断片化するなど難点があり、解析手法の確立まで至ることができなかった。以上の結果から、酸化ストレスを受けたミトコンドリアの内膜と外膜の解離には、マトリクスタンパクであるCypDが何らかの関与をしていることが考えられる。