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非古典的リガンド存在下における活性化Ｇタンパク質の定量解析

非经典配体存在下活化 G 蛋白的定量分析

基本信息

批准号：
17J06089
负责人：
西口知輝
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までの研究で、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）とGタンパク質との相互作用を一分子レベルで検出する顕微鏡観察法を確立した。今年度は、確立した手法で得られる二つの情報（GPCR複合体形成とGPCR-Gタンパク質相互作用時間）が、GPCRの活性化状態とどのような相関にあるのかを明らかにした。まず、GPCRに対する様々なリガンド（作動薬、阻害剤）を添加した際の応答を測定、評価した。さらに、リガンド-GPCR-Gタンパク質の三分子間相互作用の有無を観察した。その結果、GPCR複合体-Gタンパク質相互作用時間が膜上に存在する各GPCRの活性化状態を定量評価する指標になり得ることが明らかになった。まず、作動薬だけでなく一部の阻害剤を添加した際に、GPCR複合体形成は進行した。一方で、複合体を形成したGPCRに対するGタンパク質相互作用時間は、作動薬を加えた場合にのみ有意に増加した。すなわち、GPCR複合体-Gタンパク質相互作用時間がGPCRの活性化状態と密接に関連することが示された。さらに、リガンドが結合したGPCRだけを調べたところ、同様にGPCR複合体-Gタンパク質相互作用の安定化が見られた。したがって、活性化状態にあるGPCRは、リガンド-GPCR複合体-Gタンパク質という構造を安定化させていることが明らかになった。この結果は、活性化状態にあるGPCRを、Gタンパク質との相互作用時間をもとにして一分子レベルで検出することが可能であることを示唆する。本研究で得られた結果は予想とは異なり、バイアスを持たない作動薬においてもGPCRが均一には活性化されず、複合体形成状態に応じて異なる活性化を持つ可能性があることを示す。この不均一なGPCRの活性化が、どのように生理現象に関わっているのかを明らかにする点が今後の課題である。

In the past year's research, the microscopical method for detecting the interaction between GPCR and GPCR has been established. This year, the method of establishment is to obtain two pieces of information (GPCR complex formation and GPCR-G interaction time), GPCR activation state and correlation. The GPCR is designed to measure and evaluate the response to the action and resistance factors. The existence or absence of trimolecular interactions between GPCR-G molecules has been investigated. Results: GPCR complex-GPCR interaction time, membrane presence, quantitative evaluation of the activation state of each GPCR, and indicators of GPCR activity. However, the formation of the GPCR complex proceeds even when some of the blocking agents are added to the actuation agent. The time of interaction between GPCR and GPCR is intentionally increased in the case of complex formation. GPCR complex-G interaction time is related to the activation state and close contact of GPCR. The stabilization of GPCR complex-GPCR interaction was observed. The GPCR complex is stable in its active state. The result is that the activation state of GPCR, the interaction time of GPCR and GPCR molecules are possible. The results obtained in this study indicate the possibility that the activation of GPCRs may be maintained in a uniform state, or in a complex formation state. This heterogeneous GPCR activation is related to physiological phenomena and future problems.