自然免疫受容体ＮＬＲＰのインフラマソーム活性化機構の構造科学的解明

先天免疫受体NLRP炎症小体激活机制的结构科学阐明

• 批准号: 18J22916
• 负责人: 村上 果林
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J22916/
• 关键词: グリコサミノグリカン; 糖鎖; レクチン; がん細胞外微小環境; タンパク質三次元構造解析; 自然免疫; 糖鎖認識機構; X線結晶構造解析; 自然免疫受容体; NLRP3

本年度は、以下の3つの戦略でcochlin変異体を作成し、異なるGAG結合特異性を持つ変異体の探索に注力した；(1) Cochlinのドメイン欠損体を様々な組み合わせで作製した。(2) GAG鎖の認識にはGAG鎖上の硫酸基とのイオン結合の関与が推測されるため、分子表面に存在する塩基性アミノ酸を置換した変異体を作製した。(3) 動物細胞内で発現させる際にプロテアーゼの作用で一部分解を受けるため、そのプロテアーゼ切断配列を置換した変異体(5A_FL)を作製した。各変異体の精製試料を用いて、ELISA及びSPRを用いたGAG鎖に対する結合測定、また共同研究先である鹿児島大まで出向いてGAGアレイ解析などを行った。その結果、cochlin野生型に比較して、5A_FLではより硫酸化度の高いヘパリンやコンドロイチン硫酸Eにのみ特異的に結合すること、またC末端ドメインvWA2の欠損体は様々なGAG鎖にブロードに結合することを見出した。これらの変異体を用いて、GAG改変細胞株や前立腺癌細胞株の細胞表面へのcochlinの結合値を比較した。その結果、GAG欠損株やGAGの硫酸化が抑制された株においてcochlinの結合が顕著に減少することを見出した。また蛍光染色において、GAG発現細胞表面にプロテオグリカン染色の特徴である斑点状の染色が見られた。これらの結果から、cochlinは細胞表面上の高度硫酸化GAG発現量を反映するプローブとして利用可能だと判断した。次に前立腺癌細胞株の染色を行った結果、悪性度の高い細胞株とされるDU145について、他の細胞株よりもcochlinによって顕著に染色され、高硫酸化GAGの発現は悪性度の高い癌細胞ほど亢進している可能性が示唆された。以上のように、cochlin変異体を利用したGAG発現検出系を構築した。

This year, the following 3 strategies are based on cochlin allogeneic preparation and GAG binding specificity, and the exploration and exploration of allotypes are focused on; (1) Cochlin's のドメイン owed damage body を様々な group み合わせでproduced した. (2) The recognition of GAG lock is the connection between the sulfate group on the GAG lock and the combination of the sulfate group and the speculation on the surface of the molecule. (3) It is a part of the action of the animal cells that is present in the animal cells. , そのプロテアーゼCut arrangement をReplacement した変variant (5A_FL) をProduction した. Purified samples of each variant were combined using GAG locks for ELISA and SPR. Determination and joint research were carried out by the first であるKikajima large まででいてGAGアレイanalytic などを行った.その results, cochlin wild type に comparison して, 5A_FL ではより sulfation degree の高 いヘパリンやコンドロイチン sulfate E にのThe specific にcombination すること, またC-terminal ドメインvWA2のdeficiency body は様々なGAG lock にブロードにcombination することを见出した. Comparison of cochlin-binding properties on the cell surface of prostate cancer cell lines and prostate cancer cell lines using allogeneic and GAG-modified cells.その results, GAG deficiency strain やGAG の sulfation が inhibition さ れ た strain に お い て cochlin の combination が顕 に す る こ と を 见出 し た.また蛍光において, GAG 発appears on the cell surface, にプロテオグリカン staining, の特徴であるspot-like staining, が见られた. The result of the test and the amount of highly sulfated GAG present on the cell surface of cochlin reflect the possibility of utilization and the judgment of the result. Results of staining of prostate cancer cell lines, high-sensitivity cell lines, DU145, and other cell lines, よりもcoc hlin is stained and stained, highly sulfated GAG is present and the sex is high, cancer cells are hyperproliferated and the possibility is indicated. The above のように, cochlin 変variant を utilizes したGAG発appears 検出行をconstruct した.