自然免疫受容体ＮＬＲＰのインフラマソーム活性化機構の構造科学的解明

先天免疫受体NLRP炎症小体激活机制的结构科学阐明

• 批准号: 18J22916
• 负责人: 村上 果林
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J22916/
• 关键词: グリコサミノグリカン; 糖鎖; レクチン; がん細胞外微小環境; タンパク質三次元構造解析; 自然免疫; 糖鎖認識機構; X線結晶構造解析; 自然免疫受容体; NLRP3

本年度は、以下の3つの戦略でcochlin変異体を作成し、異なるGAG結合特異性を持つ変異体の探索に注力した；(1) Cochlinのドメイン欠損体を様々な組み合わせで作製した。(2) GAG鎖の認識にはGAG鎖上の硫酸基とのイオン結合の関与が推測されるため、分子表面に存在する塩基性アミノ酸を置換した変異体を作製した。(3) 動物細胞内で発現させる際にプロテアーゼの作用で一部分解を受けるため、そのプロテアーゼ切断配列を置換した変異体(5A_FL)を作製した。各変異体の精製試料を用いて、ELISA及びSPRを用いたGAG鎖に対する結合測定、また共同研究先である鹿児島大まで出向いてGAGアレイ解析などを行った。その結果、cochlin野生型に比較して、5A_FLではより硫酸化度の高いヘパリンやコンドロイチン硫酸Eにのみ特異的に結合すること、またC末端ドメインvWA2の欠損体は様々なGAG鎖にブロードに結合することを見出した。これらの変異体を用いて、GAG改変細胞株や前立腺癌細胞株の細胞表面へのcochlinの結合値を比較した。その結果、GAG欠損株やGAGの硫酸化が抑制された株においてcochlinの結合が顕著に減少することを見出した。また蛍光染色において、GAG発現細胞表面にプロテオグリカン染色の特徴である斑点状の染色が見られた。これらの結果から、cochlinは細胞表面上の高度硫酸化GAG発現量を反映するプローブとして利用可能だと判断した。次に前立腺癌細胞株の染色を行った結果、悪性度の高い細胞株とされるDU145について、他の細胞株よりもcochlinによって顕著に染色され、高硫酸化GAGの発現は悪性度の高い癌細胞ほど亢進している可能性が示唆された。以上のように、cochlin変異体を利用したGAG発現検出系を構築した。

This year, the following three years will briefly show that the cochlin system is made, and the special GAG is combined with special information to explore the focus of attention; (1) the Cochlin system is responsible for the development of the system. (2) the combination of sulfates and sulfates on the GAG, and the presence of phenylethanes on the surface of the molecules. (3) in vivo, some of the animals are affected by the action of the drug, and the configuration is cut off. The body (5A_FL) is cut off. The fine materials of each body were measured by the combination of ELISA, ELISA and SPR, and the results were analyzed by the combination of GAG and GAG. The results showed that the results of cochlin wild type, 5A_FL wild type, high sulfation degree, high sulfation degree The cell surface of the prostatic adenocarcinoma cell line was stained with GAG, and the surface of the cell was stained with cochlin. The results showed that the sulfation of GAG-deficient strain GAG inhibited the growth of strain-specific cochlin in combination with low concentration of phenotype. Light staining and GAG staining showed that the cell surface was stained with speckles. The results showed that the amount of highly sulfated GAG on the surface of cochlin cells reflected that it was possible to make use of the possibility to determine the amount of GAG. The results of staining of secondary prostatic adenocarcinoma cell lines showed that the possibility of hypertrophied adenocarcinoma cell lines with high degree of sex, high degree of sex, high degree of gonadotropin, high degree of sex, high degree of sexuality, high degree of gonadotropin, hypersulfation of GAG, hypersulfation of GAG, staining, staining The above information system, cochlin system, uses the information GAG to show that the system is not working properly.