特定臓器の分子時計を標的かつ遠隔に操作する技術の開発と応用

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実験１in vitroにおけるマイクロ電流刺激（MCS）によるリズム操作:培養細胞として、C57BL/6J雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトを、常法に従って継代培養し、各試験に用いた。微弱電流刺激装置の電極を用いて一定時間電気刺激を行った。時計遺伝子の発現量に及ぼすMCSの影響について、各遺伝子のmRNA発現量およびタンパク質量を測定した。その結果MCSによりPer1の転写活性が促進した。そこでPer1プロモーター領域を解析した結果、カルシウムイオンやcAMP等の刺激により活性化する転写因子cAMP response element binding protein（CREB）の応答配列CREが存在することを確認した。次に、MCSによるPer1遺伝子の転写活性化の機構を解明するためにPer1遺伝子のCRE応答配列を含むプロモーター配列とCRE応答配列を含まないプロモーター配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだベクターをアストロサイトにトランスフェクションし、MCS後のルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、MCSはPer1遺伝子のプロモーター領域に存在するCRE応答配列を介して転写を促進することを明らかにした。CREBによる転写活性には、CREBタンパク質のリン酸化が重要である。そこで、MCS後のCREBタンパク質のリン酸化を測定した。その結果、MCSの刺激によりCREBタンパク質のリン酸化が促進した。次に、CREBのリン酸化酵素Protein kinase A（PKA）の阻害剤H89を用いた。その結果、MCSによるCREBタンパク質のリン酸化とPer1遺伝子の増加は抑制された。以上の結果よりMCSはCREBタンパク質のリン酸化の活性化を介して、Per1遺伝子の発現を増加することを明らかにした。