特定臓器の分子時計を標的かつ遠隔に操作する技術の開発と応用

目标和远程操纵特定器官分子钟的技术的开发和应用

• 批准号: 21K18249
• 负责人: 大戸 茂弘
• 金额: $ 16.22万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K18249/
• 关键词: 分子時計; 微弱電流刺激; 遠隔操作; 標的臓器

実験１in vitroにおけるマイクロ電流刺激（MCS）によるリズム操作:培養細胞として、C57BL/6J雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトを、常法に従って継代培養し、各試験に用いた。微弱電流刺激装置の電極を用いて一定時間電気刺激を行った。時計遺伝子の発現量に及ぼすMCSの影響について、各遺伝子のmRNA発現量およびタンパク質量を測定した。その結果MCSによりPer1の転写活性が促進した。そこでPer1プロモーター領域を解析した結果、カルシウムイオンやcAMP等の刺激により活性化する転写因子cAMP response element binding protein（CREB）の応答配列CREが存在することを確認した。次に、MCSによるPer1遺伝子の転写活性化の機構を解明するためにPer1遺伝子のCRE応答配列を含むプロモーター配列とCRE応答配列を含まないプロモーター配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだベクターをアストロサイトにトランスフェクションし、MCS後のルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、MCSはPer1遺伝子のプロモーター領域に存在するCRE応答配列を介して転写を促進することを明らかにした。CREBによる転写活性には、CREBタンパク質のリン酸化が重要である。そこで、MCS後のCREBタンパク質のリン酸化を測定した。その結果、MCSの刺激によりCREBタンパク質のリン酸化が促進した。次に、CREBのリン酸化酵素Protein kinase A（PKA）の阻害剤H89を用いた。その結果、MCSによるCREBタンパク質のリン酸化とPer1遺伝子の増加は抑制された。以上の結果よりMCSはCREBタンパク質のリン酸化の活性化を介して、Per1遺伝子の発現を増加することを明らかにした。

1in vitro current stimulation (MCS) operation: culture cells, C57BL/6J male wild-type cells and their origin, normal method, culture, each test. The electrodes of the weak current stimulation device are used for a certain period of time for electrical stimulation. The mRNA expression and quality of each gene were measured. The MCS results in a higher level of activity Per1. The results of the analysis of the Per1 response domain confirm the existence of CRE in response to stimulation by cAMP and the like. In addition, the mechanism of writing activation of Per 1 gene in MCS was clarified, and the CRE activity of Per 1 gene was measured after MCS. As a result, MCS Per1 has been identified as a domain with CRE configuration. CREB activity is important for CREB activity. After the MCS, the CREB was determined. As a result, MCS stimulation can promote CREB activity. Next, CREB's Protein kinase A (PKA) inhibitor H89 is used. The results of MCS, CREB and Per1 gene amplification and suppression are as follows: The above results show that the activation of CREB protein and the increase of Per1 protein production are important factors for the development of MCS.