時間制御型遺伝子発現ベクターの開発

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本研究では、生体リズムの分子制御メカニズムを応用し、蛋白あるいは遺伝子をリズミカルに発現できるリズム発振ベクターを作製した。まずプロモーター上流域に時計遺伝子応答配列を含む合成レポーターベクターを作製した。挿入配列は、時計遺伝子の5'上流域に存在する時計遺伝子応答配列を基に設計した。次にルシフェラーゼレポーターベクターをC6細胞ヘトランスフェクトし、36-48時間後にDexamethazone(DEX)刺激により細胞を同調した。同調後、基質であるルシフェリンを添加し、細胞から発せられる化学発光強度を微弱発光検出器で経時的に測定した。その後、ルシフェラーゼレポーターベクターを各時計遺伝子の発現ベクターと共に、C6細胞またはHepG2細胞ヘトランスフェクトし、48時間培養後ルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。既存の時計遺伝子のレポーターベクターのリズム発振機能を検討したところ、それぞれのベクターから発せられる化学発光強度には約24時間周期のリズムが認められ、バイオルミネセント法によるリズム機能評価系の妥当性が確認された。次に、時計遺伝子応答配列を含む合成レポーターベクターを作製し、デュアルルシフェラーゼアッセイにより時計遺伝子への反応性について検討した。その結果、転写促進因子による転写活性の上昇と転写抑制因子による転写活性の低下が確認され、さらに、バイオルミネセント法によって各合成ベクターは既存の時計遺伝子と同様のリズム発振機能を有することが明らかになった。本研究では、時計遺伝子応答配列を基に、リズムを発振するベクターの作製に成功した。今後、目的とする遺伝子のリズミカルな発現について更に詳細な機能評価を行うことで、時間薬物送達システムへの応用が期待される。