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Development of ASOs which up-regulate back-splicing producing circular RNAs

开发上调反向剪接产生环状 RNA 的 ASO

基本信息

批准号：
22K05315
负责人：
山田剛史
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

我々は、「細胞外から投与したRNA結合性低分子やアンチセンスオリゴ(AON)によって、細胞内の特定の環状RNAの生合成量を増大させることができるか？」というコンセプトを提案し、RNA結合性低分子NCDを用いて実現可能性を証明した。哺乳類の環状RNAは、一般的に一つあるいは複数のエキソンから構成され、「バックスプライシング」によって生合成される。バックスプライシングは、環状化するエキソンの上流と下流のイントロンが、水素結合等によって架橋構造を形成し、上流のイントロンに存在するブランチポイントアデノシンと下流のイントロンの5’スプライシングサイトが近接することで促進される。この架橋構造を促進する分子をデザインすることで、特定の環状RNAの生合成を促進させられるというのが我々のアイデアである。NCDは、二重鎖RNA中に存在するUGGAA/UGGAA配列に強く結合し、二重鎖を安定化する。まず、環状化するエキソンの上流と下流のイントロン内にNCD結合部位を挿入したモデルpre-mRNAを産生するプラスミドを作成し、それを培養細胞に導入しモデル細胞を作成した。このモデル細胞にNCDを添加した所、NCD濃度に依存した環状RNA生合成量の増大を確認した。上記のコンセプトをさらに発展させるため、AONを用いた検討を行った。具体的には環状化するエキソンを挟む上流下流のイントロンと水素結合して架橋構造を形成するAONをデザインし、NCDを用いた実験で作成したモデル細胞でAONの効果を検証した。結果、標的環状RNAは、AONの投与量に依存した増大を示し、最大で3.4倍増大した。一方、スクランブル配列では増大は認められず、AONがイントロン間の架橋構造を強化することで環状RNA合成量が増大したことが強く示唆された。

I replied,"Extracellular RNA binding low molecular weight proteins (AON) increase the production of specific circular RNA in cells." The possibility of using RNA binding low molecular NCD was demonstrated. Mammalian circular RNA is composed of a general sequence of multiple sequences, and is synthesized by a sequence of sequences. The formation of bridging structures, the existence of upstream and downstream structures, and the formation of water-element bonds promote the formation of bridging structures, the existence of upstream and downstream structures, and the promotion of proximity. The bridging structure promotes the synthesis of specific cyclic RNA molecules. NCD and double-locked RNA exist in the UGGAA/UGGAA alignment, which is strongly bound and double-locked. NCD binding sites are introduced into the upstream and downstream regions of the cell culture system. The increase in the amount of circular RNA produced by these cells was confirmed by the addition of NCD and the concentration of NCD. On the other hand, it's not a bad idea. Specifically, it is possible to form a cyclic AON by combining the upstream and downstream components with the NCD. The results showed that the target circular RNA increased by 3.4 times depending on the amount of AON administered. The amount of cyclic RNA synthesized increased due to the increase in the number of cyclic RNA molecules and the enhancement of the bridging structure between them.