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組織特異的ノックアウト手法を用いた骨格筋ジャンクトフィリンのサブタイプ別機能解析

使用组织特异性敲除法按亚型对骨骼肌嗜肉素进行功能分析

基本信息

批准号：
22K06828
负责人：
中田勉
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

骨格筋の興奮収縮連関は、細胞膜上のL型Ca2+チャネルと、筋小胞体膜上のリアノジン受容体が協調することで引き起こされる。L型Ca2+チャネルとリアノジン受容体が共局在することは，電気信号をカルシウム信号に変換するために必須であり、その異常は致死的である。これらの分子が近接する「場」を結合膜と呼び、ジャンクトフィリン（JP）はこの構造を維持する分子である。成熟した骨格筋にはJP1およびJP2の二つのサブタイプが発現しているが、これらの機能的差異の詳細は明らかになっていない。そこで、骨格筋の興奮収縮連関におけるJP1とJP2の生理学的役割を、サブタイプ別に明らかにすることを目的に研究を行った。解析にはCASAAV法を用いることとした。本法では、Cre依存的にCas9-GFPを発現するトランスジェニックマウス（Flox-Cas9-GFPマウス）に、Cre配列と目的遺伝子に対するgRNAを発現するアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）を投与する。この方法により、特定組織の遺伝子のみを欠損させうることが報告されている。そこで、AAVにJP1、JP2の遺伝子を標的としたgRNAを組み込み、これを成獣Flox-Cas9-GFPマウスの前脛骨筋および短趾屈筋に注射した。しかし、感染4週間後に前脛骨筋の収縮力を測定したところ、有意な変化は認められなかった。さらにJP1、JP2のウェスタンブロッティングを行ったところ、十分な発現量の減少が認められなかった。このことから、本条件では解析が困難であることが明らかとなった。現在、より高い遺伝子欠損効率を達成するため、AAVの投与量およびgRNA配列の最適化を行っている。

The excitation and contraction of bone cells are related to the L-type Ca2 + generation on the cell membrane and the coordination of the receptor on the cell membrane. L-type Ca2 + ions are isolated from the receptor. The molecules are close to each other. The "field" binds to the membrane. The structure of the membrane is maintained. The difference between mature and mature bone ribs JP1 and JP2 is shown in detail. Therefore, we are conducting research on the physiological separation of JP1 and JP2 in the connection between the excitation and contraction of bones and muscles, and the clear distinction between them. CASAAV method This method is based on the Cre-dependent Cas9-GFP gene expression vector (Flox-Cas9-GFP), Cre-alignment and target gene expression vector (AAV). This method is based on the analysis of the data of specific organizations. AAV, JP1, JP2 and other genes were injected into the anterior tibial tendon and the posterior tibial tendon of the short toe. 4 weeks after infection, the contractile force of the anterior tibial tendon was measured. JP1, JP2, JP2, JP3, JP4, JP5, JP6, JP7, JP8, JP9, JP9, JP This condition is difficult to resolve. Now, we can optimize the AAV dosage and gRNA alignment to achieve high efficiency.