組織特異的ノックアウト手法を用いた骨格筋ジャンクトフィリンのサブタイプ別機能解析

使用组织特异性敲除法按亚型对骨骼肌嗜肉素进行功能分析

基本信息

批准号：
22K06828
负责人：
中田勉
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

骨格筋の興奮収縮連関は、細胞膜上のL型Ca2+チャネルと、筋小胞体膜上のリアノジン受容体が協調することで引き起こされる。L型Ca2+チャネルとリアノジン受容体が共局在することは，電気信号をカルシウム信号に変換するために必須であり、その異常は致死的である。これらの分子が近接する「場」を結合膜と呼び、ジャンクトフィリン（JP）はこの構造を維持する分子である。成熟した骨格筋にはJP1およびJP2の二つのサブタイプが発現しているが、これらの機能的差異の詳細は明らかになっていない。そこで、骨格筋の興奮収縮連関におけるJP1とJP2の生理学的役割を、サブタイプ別に明らかにすることを目的に研究を行った。解析にはCASAAV法を用いることとした。本法では、Cre依存的にCas9-GFPを発現するトランスジェニックマウス（Flox-Cas9-GFPマウス）に、Cre配列と目的遺伝子に対するgRNAを発現するアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）を投与する。この方法により、特定組織の遺伝子のみを欠損させうることが報告されている。そこで、AAVにJP1、JP2の遺伝子を標的としたgRNAを組み込み、これを成獣Flox-Cas9-GFPマウスの前脛骨筋および短趾屈筋に注射した。しかし、感染4週間後に前脛骨筋の収縮力を測定したところ、有意な変化は認められなかった。さらにJP1、JP2のウェスタンブロッティングを行ったところ、十分な発現量の減少が認められなかった。このことから、本条件では解析が困難であることが明らかとなった。現在、より高い遺伝子欠損効率を達成するため、AAVの投与量およびgRNA配列の最適化を行っている。

骨骼肌的激发和收缩连接是由L型Ca2+通道在细胞膜上与肌浆网膜上的Ryanodine受体的配位引起的。 L型Ca2+通道的共定位和Ryanodine受体对于将电信号转化为钙信号至关重要，并且异常是致命的。这些分子相邻的“场”称为结合膜，而邻苯二甲酸酯（JP）是维持这种结构的分子。 JP1和JP2的两个亚型在成熟的骨骼肌中表达，但尚未揭示这些功能差异的细节。因此，我们进行了一项研究，目的是阐明JP1和JP2在骨骼肌中通过亚型在骨骼肌中的激发和收缩缔合中的生理作用。 Casaav方法用于分析。在这种方法中，将表达感兴趣基因的CRE序列和GRNA的腺相关病毒载体（AAV）用于以CRE依赖性方式表达Cas9-GFP的转基因小鼠（Flox-Cas9-GFP小鼠）。据报道，这种方法会导致特定组织的基因缺乏。因此，将靶向JP1和JP2基因的GRNA掺入了AAV中，并将其注入成年Flox-Cas9-GFP小鼠的胫骨前和屈肌Digitorum Broadius。但是，当感染四周后测量胫骨前肌的收缩力时，未观察到显着变化。此外，当执行JP1和JP2的蛋白质印迹时，未观察到表达水平的足够降低。这表明在这些条件下很难进行分析。当前，正在进行AAV剂量和GRNA序列优化，以实现更高的基因缺乏效率。