ESTクローンを用いたアラビドプシスの天然物生合成系のリバースジェネティクス

使用EST克隆的拟南芥天然产物生物合成系统的反向遗传学

• 批准号: 08878082
• 负责人: 斉藤 和季
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08878082/
• 关键词: ESTクローン; シロイヌナズナ; 硫酸イオントランスポーター; cDNA; システイン生合成

【目的】アントシアニン生合成において、ロイコアントシアニジンからのアントシアニジンの生成反応はアントシアニジン合成酵素(ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ)(LDOX)により触媒されることが分子遺伝学的に示唆されている。しかし、本酵素の活性をin vitroで検出した例はなく、酸化酵素の他に脱水酵素の存在の可能性等、反応の詳細は明らかとされていない。そこで本研究ではアカジソ葉で特異的に発現するLDOXのcDNAを大腸菌で高発現させて得た組み換え精製タンパク質について、in vitroでの酵素化学的解析を行った。【実験・結果】1.LDOXの発現とアントシアニン含有量の解析LDOOXのNorthern解析並びにWestern解析を行ったところ、LDOXのmRNAとタンパク質はアカジソの葉と茎に特異的に発現していることが示され、これらの発現パターンは各組織のアントシアニン含有パターンに一致した。2.精製タンパク質の酵素化学的解析LDOX cDNAのORF領域を大腸菌高発現ベクターに導入し高発現系を構築した。その結果、発現誘導後の大腸菌抽出液にLDOX活性が確認された。この反応系より二価鉄イオン、アスコルビン酸、または2-オキソグルタル酸を除いた系ではLDOX活性の顕著な減少がみられ、LDOXが2-オキソグルタル酸依存性酸化酵素であることが生化学的に証明された。本組み換えタンパク質を精製し解析を行った結果、精製タンパク質においてもLDOX活性が確認された。このことから、ロイコアントシアニジンからのアントシアニジンの生成には本酵素だけで必要十分であり、特異的な脱水酵素はなくても反応の進行することが明らかとなった。

【 objective 】 ア ン ト シ ア ニ ン biosynthesis に お い て, ロ イ コ ア ン ト シ ア ニ ジ ン か ら の ア ン ト シ ア ニ ジ ン の generated against 応 は ア ン ト シ ア ニ ジ ン synthetase (ロ イ コ ア ン ト シ ア ニ ジ ン ジ オ キ シ ゲ ナ ー ゼ) (LDOX) に よ り catalyst さ れ る こ と が molecules but 伝 learn に in stopping さ れ て い る. を の し か し, the enzyme activity in vitro で 検 out し た example は な く の he に dehydration acidification enzyme and enzyme の is の possibilities, such as anti 応 の detailed は Ming ら か と さ れ て い な い. そ こ で this study で は ア カ ジ ソ leaf で specific に 発 now す る LDOX の cDNA を coliform で high 発 now さ せ て have た group み exchange え refined タ ン パ ク qualitative に つ い て, the in vitro で の enzyme chemistry analytical line を っ た. 【 be 験 · results 】 1. LDOX の 発 now と ア ン ト シ ア ニ ン contain quantity の parsing LDOOX の Northern parse and び に Western analytical line を っ た と こ ろ, LDOX の mRNA と タ ン パ ク qualitative は ア カ ジ ソ の leaf と stem に specific に 発 now し て い る こ と が shown さ れ, こ れ ら の 発 now パ タ ー ン は each The organization <s:1> ア トシアニ トシアニ トシアニ <e:1> contains パタ に に に consistent <s:1> た. 2. Chemical analysis of refined タ パ パ <s:1> plasmid enzyme, LDOX cDNA cdna, ORF field を escherichia coli high occurrence ベ タ <s:1> に に に introduction of <s:1> high occurrence series を construction of た. Youdaoplaceholder0 results, にLDOX activity in the <s:1> escherichia coli extract after induction が confirmation された. こ の anti 応 department よ り two objects 価 iron イ オ ン, ア ス コ ル ビ ン acid, ま た は 2 - オ キ ソ グ ル タ ル acid を except い た department で は LDOX active の 顕 the な reduce が み ら れ, LDOX が 2 - オ キ ソ グ ル タ dependency ル acid acidification enzyme で あ る こ と が biochemistry に prove さ れ た. Change this み え タ ン パ ク qualitative analytical line を っ を refined し た results, refined タ ン パ ク qualitative に お い て も LDOX active が confirm さ れ た. こ の こ と か ら, ロ イ コ ア ン ト シ ア ニ ジ ン か ら の ア ン ト シ ア ニ ジ ン の generated に は this enzyme だ け で very necessary で あ り specific な dehydration and enzyme は な く て も anti 応 の for す る こ と が Ming ら か と な っ た.