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ESTクローンを用いたアラビドプシスの天然物生合成系のリバースジェネティクス

使用EST克隆的拟南芥天然产物生物合成系统的反向遗传学

基本信息

批准号：
08878082
负责人：
斉藤和季
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Chiba University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

【目的】アントシアニン生合成において、ロイコアントシアニジンからのアントシアニジンの生成反応はアントシアニジン合成酵素(ロイコアントシアニジンジオキシゲナーゼ)(LDOX)により触媒されることが分子遺伝学的に示唆されている。しかし、本酵素の活性をin vitroで検出した例はなく、酸化酵素の他に脱水酵素の存在の可能性等、反応の詳細は明らかとされていない。そこで本研究ではアカジソ葉で特異的に発現するLDOXのcDNAを大腸菌で高発現させて得た組み換え精製タンパク質について、in vitroでの酵素化学的解析を行った。【実験・結果】1.LDOXの発現とアントシアニン含有量の解析LDOOXのNorthern解析並びにWestern解析を行ったところ、LDOXのmRNAとタンパク質はアカジソの葉と茎に特異的に発現していることが示され、これらの発現パターンは各組織のアントシアニン含有パターンに一致した。2.精製タンパク質の酵素化学的解析LDOX cDNAのORF領域を大腸菌高発現ベクターに導入し高発現系を構築した。その結果、発現誘導後の大腸菌抽出液にLDOX活性が確認された。この反応系より二価鉄イオン、アスコルビン酸、または2-オキソグルタル酸を除いた系ではLDOX活性の顕著な減少がみられ、LDOXが2-オキソグルタル酸依存性酸化酵素であることが生化学的に証明された。本組み換えタンパク質を精製し解析を行った結果、精製タンパク質においてもLDOX活性が確認された。このことから、ロイコアントシアニジンからのアントシアニジンの生成には本酵素だけで必要十分であり、特異的な脱水酵素はなくても反応の進行することが明らかとなった。

[objective] to study the synthesis of synthetic enzymes in the presence of synthetic enzymes. [objective] to induce the synthesis of synthetic enzymes. [objective] to induce the synthesis of synthetic enzymes (LDOX). The activity of this enzyme, the activity of this enzyme, the in vitro of this enzyme, the possibility of the existence of other dehydration enzyme, and so on. The purpose of this study is to detect the high levels of LDOX and cDNA bacteria in this study. the analysis of enzyme chemistry in in vitro has been studied. [results] 1.LDOX results show that there are significant differences in LDOOX Northern analysis and Western analysis. The results show that each organization contains the same information. two。 The analysis of enzyme chemistry in the field of LDOX cDNA ORF. The high level of bacteria in the field shows that there is an increase in the number of bacteria in the system. The results showed that the LDOX activity of the extract of Shigella typhimurium was confirmed. It is known that the biochemistry of the acid-dependent acidifying enzyme, LDOX-dependent acidifying enzyme, acid-dependent acidifying enzyme This group is responsible for the analysis of the results of the analysis of the results of the bank. This is to ensure that the LDOX activity is verified. The production of this enzyme is very important, the specific dehydration enzyme is very important, and the specific dehydration enzyme is very important.