生合成反応の遺伝子レベルでの精密な解析と超天然酵素分子の創製

在基因水平上精确分析生物合成反应并创造超天然酶分子

基本信息

  • 批准号:
    06240207
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.41万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    1994
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1994 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

[目的]薬用植物成分の生合成に関わる遺伝子をクローン化し、異種生物で高発現することによりその生産を図る研究は、今後ますます重要な課題になると思われる。植物に含まれる非タンパク性β-置換アラニン類には、スイカなどのウリ科植物に特異的なβ-ピラゾールアラニンをはじめ、ギンゴウカン(Leucaena leucocephala)に含まれるミモシンや、シクンシ(Quisqualis indica var.villosa)に含まれる中枢神経興奮性グルタミン酸レセプターのアゴニストとして注目を集めているキスカル酸など薬学的に興味深い物質が多い。これらの非タンパク性β-置換アラニン類の生合成は、ピリドキサールリン酸のアミノアクリル酸中間体を共通の酵素反応中間体として、システイン合成酵素によって触媒されている。そこでスイカシステイン合成酵素cDNAの大腸菌高発現系を作製し、この系を用いてこれら非タンパク性β-置換アラニン類のin vitroおよびin vivo合成に応用した。[方法・結果]スイカ発芽体からクローン化したシステイン合成酵素cDNA[1]をT7プロモーターを持つ大量発現ベクターpET3dのNcoI部位に導入したプラスミドpCEN1を構築した。このプラスミドをT7 RNAポリメラーゼ遺伝子が溶原化した大腸菌BL21に導入したところ、スイカシステイン合成酵素タンパクが大腸菌全タンパクの10〜20%に達した。大腸菌の無細胞抽出液中に基質を加え反応させたin vitro酵素反応の結果、β-ピラゾールアラニンのみならず、キスカル酸、ミモシンの生合成も可能であった。また、この高発現系の大腸菌培養液中にβ-ピラゾールアラニン生合成の前駆体であるピラゾールと0-アセチルセリンあるいはセリンおよび誘導剤IPTGを加えて培養したところ、培養液中にβ-ピラゾールアラニンが蓄積した。以上のように異種生物でのこれら植物特異的二次代謝産物の大量生産系を確立することができた。
[Objective] To study and think about the important problems related to the biosynthesis of plant components and the development of xenobiotics. Plant species contain non-specific β-substitutions, which are specific to plants of different families.(Leucaena leucocephala) contains the central nervous excitatory substances, such as Quisqualis indica var.villosa, which are highly active substances in the central nervous system. The synthesis of these non-reactive β-substitutional enzymes is a common enzyme reaction intermediate and catalyst for the synthesis of β-substitutional enzymes. The high expression system of E. coli cDNA was used in vitro synthesis and in vivo synthesis. [Method·Results] A large amount of cDNA[1] was produced by introducing pCEN1 into the NcoI site of pET3d. The T7 RNA gene was introduced into E. coli BL21 to produce 10 - 20% of the total E. coli DNA. E. coli cell-free extracts from the substrate added to the reaction in vitro enzyme reaction results, β-glucuronic acid, glucuronic acid, glucuronic acid production may be affected. In the Escherichia coli culture solution of this high development system, beta-protein is produced and synthesized into precursors, and beta-protein is accumulated in the culture solution by adding IPTG. A system for mass production of plant-specific secondary metabolites of these xenobiotic organisms has been established.

项目成果

期刊论文数量(4)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
K.Saito,et al.: "Overex pression of a plant uysteine synthasl genl and biosynthesis of a plaut specific metabo lite." Canadian Journal of chemistry. 72. 188-192 (1994)
K.Saito 等人:“植物尿氨酸合酶基因的过度表达和 plaut 特异性代谢物的生物合成。”
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
H.Szsuki,et al.: "A novel O-tigloxyltransferase for alkaloid biosynthesis in plants" Journal of Biological Chemistry. 269. 15853-15860 (1994)
H.Szsuki 等人:“一种用于植物生物碱生物合成的新型 O-tigloxyltransferase”《生物化学杂志》。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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  • 通讯作者:
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    2017
  • 资助金额:
    $ 1.41万
  • 项目类别:
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知道了