神経線維腫症2型遺伝子産物(Merlin)の神経系腫瘍形成抑制機構の解析‥ Merlinに対する細胞内結合タンパク質の同定、及びその構造と相互作用機構の解析‥

分析神经纤维瘤病2型基因产物（Merlin）抑制神经系统肿瘤形成的机制，鉴定Merlin的细胞内结合蛋白，并分析其结构和相互作用机制。

• 批准号: 09877277
• 负责人: 荒木 令江
• 金额: --
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09877277/
• 关键词: NF2; 神経線維腫症2型; merlin; 腫瘍抑制遺伝子; poly(ADP-ribose)polymerase; PARP; 細胞内シグナル伝達; 細胞内会合タンパク質

神経線維腫症2型(NF2)は多発性頭蓋内良性腫瘍を伴うことで特徴づけられる遺伝疾患で、患者の予後は極めて悪いことで知られる。その原因遺伝子(NF2遺伝子)の欠失・変異は、非NF2患者における散発性の腫瘍でも高い頻度で起こっていることなどから、NF2遺伝子産物Merlinが細胞内で腫瘍抑制分子として機能していることが示唆される。Merlinが関わる細胞内でのシグナル伝達機構を明らかにすることを目的として、Merlinと会合する細胞内蛋白質の単離・同定を試み、これらの分子の相互作用解析を行った。大腸菌発現GST-merlin融合蛋白質固相化カラムを用い、牛脳可溶化物よりmerlinに特異的に結合する5種の蛋白質(p165,P145,P125,P85,P70)を検出した。これら蛋白質の単離・酵素消化・RP-HPLCの後、各ペプチドのアミノ酸配列を決定し、Data Baseによる解析を行ったところ、p125はpoly(ADP-ribose)polymerase(PARP)の部分配列と全て一致することが判明した。細胞可溶化タンパク質の抗PARP抗体による免疫沈降物中にmerlinが、又HA-merlinを過剰発現させたCOS細胞の抗HA抗体沈降物からPARPが検出され、細胞内でmerlinとPARPが相互に会合していることが確認された。更にmerlin及びPARP両分子の発現ベクターをVA13細胞の核内にmicroinjectionし、各分子の細胞内発現パターンを共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、merlinは細胞質全体に顆粒状に発現し、特に核周辺部でPARPと共存していることが判った。又、各種GST-merlin,-PARPフラグメントの結合実験から、PARPとNF2蛋白質の結合には、NF2分子の19から339番目のアミノ酸配列と、PARP分子の337から580番までの配列が重要であることがわかった。更に、PARPの酵素活性(poly ADP-ribosilation)はGST-merlin共存下で上昇し、PARPの活性化によりmerlinN末端部がpoly ADP-ribosylationされることが判明した。以上の結果からmerlinはその高変異部位を介してPARPやその他の蛋白質と相互作用することによって、お互いの活性を制御し、腫瘍抑制の細胞内シグナルに関わっている可能性が考えられた。

God 経 line d swollen disease type 2 (NF2) は 発 sex within the cranium more benign swollen sores を with う こ と で, 徴 づ け ら れ る heritage で 伝 disease, patients after の to は め て 悪 い こ と で know ら れ る. そ の reason but 伝 child (NF2 heritage 伝) の owe NF2 patients lost - different は, に お け る scattered 発 sex is の is swollen sores で も い frequency で up こ っ て い る こ と な ど か ら, traces of NF2 伝 zi chan content Merlin が で swollen sores in the cell inhibitory molecules と し て function し て い る こ と が in stopping さ れ る. Merlin が masato わ る intracellular で の シ グ ナ ル 伝 of institutions を Ming ら か に す る こ と を purpose と し て, Merlin meet と す る intracellular protein の 単 leaves, with を try み, こ れ ら の molecular の interaction line analytical を っ た. Coliform bacteria present with GST-merlin fusion protein immobilization カラムを using カラムを and bovine 脳 soluble substance よ <s:1> merlinに specifically に to bind する five <s:1> proteins (p165,P145,P125,P85,P70)を検 to produce た. The <s:1> れら protein <s:1> 単 is digested by enzyme and RP-HPLC. Then, the various ペプチド <s:1> ア and ノ ノ acids are arranged を to determine the を and Data Line Base に よ る parsing を っ た と こ ろ, p125 は poly real (ADP ribose) polymerase (PARP) の department assign column と て all consistent す る こ と が.at し た. Cells can melt タ ン パ ク qualitative の PARP antibody resistance に よ る immune sink in に merlin が and HA - merlin を through turning 発 now さ せ た COS cell の anti HA antibody sink content か ら PARP が 検 out さ れ, intracellular で merlin と PARP が meet mutual に し て い る こ と が confirm さ れ た. More に merlin and び PARP struck molecular の 発 now ベ ク タ ー を の VA13 cells within the nuclear に microinjection し 発 now, various molecular の cell パ タ ー ン を total focus レ ー ザ ー 顕 micromirror で 観 examine し た と こ ろ, merlin は all に granular cytoplasm に 発 し now, trevor に nuclear weeks 辺 で PARP と coexist し Youdaoplaceholder0 て る とが とが とが ruled った. Again, all kinds of GST - merlin, PARP フ ラ グ メ ン ト の combination be 験 か ら, PARP と NF2 protein の combining に は, NF2 molecular の 19 か ら 339's mesh の ア ミ ノ acid with column と, PARP molecular の 337 か ら 580 times ま で の match column が important で あ る こ と が わ か っ た. Under the coexistence of に, PARP enzyme activity (poly ADP-ribosilation) and GST-merlin, で increases で, PARP <s:1> is activated によ, the terminal of the <s:1> merlinN がpoly ADP-ribosylationされる とが とが determines た. の above results か ら merlin は そ の high - different parts を interface し て PARP や そ の he と の protein interaction す る こ と に よ っ て, お mutual い の inhibition の を royal し, swollen sores intracellular シ グ ナ ル に masato わ っ て い る possibility が exam え ら れ た.

项目成果

Smedsrod B, et.al.: "Advanced glycation end products are eliminated by scavenger-receptor mediatet endocytosis in hepatic sinusoidal Kupffer and endothelial cells." Biochemical Journal. 322. 567-573 (1997)

Smedsrod B 等人：“晚期糖基化终产物通过肝窦 Kupffer 细胞和内皮细胞中的清道夫受体介导的内吞作用消除。”

Imai N, et.al.: "Histological localization of advanced glycosylation end products in the progression of diabetic nephropathy." Nephron. 76(2). 153-160 (1997)

Imai N 等人：“糖尿病肾病进展中高级糖基化终产物的组织学定位。”

Araki N, et.al.: "Neurofibromatosis type 2." Gan To Kagaku Ryoho. 24(11). 1427-1431 (1997)

Araki N 等人：“2 型神经纤维瘤病。”

Araki N, et.al.: "“NF2"癌遺伝子・癌抑制遺伝子/Bio Science用語ライブラリー/実験医学別冊" 田矢洋一・山本雅編・洋土社, 191 (1997)

Araki N 等人：“‘NF2’癌基因/肿瘤抑制基因/生物科学术语库/实验医学分卷”，Yoichi Taya 和 Masa Yamamoto 编辑，Yodosha，191 (1997)