個体への簡便で効率的な遺伝子導入法の確立

建立简单高效的基因导入个体的方法

基本信息

  • 批准号:
    09876075
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.41万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
  • 财政年份:
    1997
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    1997 至 1999
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

[序論]我々は簡便なtransgenicマウスの作製を目的に、マウス精巣へDNAを直接注入し、このDNA注入♂マウスと♀マウスとの交配により外来性DNAが精子を通じ、胎仔へ伝達されるかどうかを検討して来た。その結果、外来性DNAが受精を通じ、高率(50-90%)に卵側(F0世代)へ伝達されるものの、外来性DNAは1細胞当たり1copy以下であり、また、その遺伝子発現も検出されなかった。今回、幾つかの市販されている遺伝子導入試薬を検討することにより、本法における導入遺伝子コピー数の増加、遺伝子発現の可能性を検討した。[方法]検討した試薬は、FuGENE6(Boehringer Mannheim)、Transfectam(Promega)、SuperFect(Qiagen)、Effecten(Qiagen)、CaPO4 transfection kit(Stratagene)、DEAE-dextran(Stratagene)、Lipofectin(GIBCO BRL)。外来性DNAとしては、直鎖状pCAGGS-lacZ[reporter遺伝子としてlacZ(β-galactosidase)遺伝子を内蔵]を使用。注入するDNAの濃度は、どの場合も4μg/testisとした。遺伝子導入試薬の量は、製造業者のprotocolにおおよそ従った。ICRマウス精巣へDNAの注入は、これまでの方法(Sato et al.,1998,1999)に依った。注入後、2、3日目にPMSG-hCG投与発情期B6C3F1雌マウスと交配させた。交配後、E12.4にて開腹し、yolk sacをDNA解析(PCR-Southern解析及びgenomic Southern解析)に、頭部をX-Gal染色に、頭部以下の体部をRNA解析(RT-PCR解析)に付した。[結果/展望] いずれの試薬を用いた場合でもPCR-Southern解析で評価する限り、40-100%のF0胎仔への遺伝子導入効率が達成された。特に、Transfectam、DEAE-dextranが全般的にhigher copiesと思われる遺伝子導入patternを示した。しかし、導入copy数は、やはり低かった(<1copy/diploid cell)。遺伝子発現も数個体に見られたが、その量は、nested RT-PCRで初めて検出される程で、極めて低かった。(Sato et al.,Transgenics,in press)。このように、市販の遺伝子導入試薬を用いても、本法の改善は大幅にはされなかった。他のgroupは、最低3回以上のDNA/遺伝子導入試薬複合体の精巣へのinjectionで最高5copies/diploid cellの遺伝子導入を成功させているので、今後は、複数回投与による検討を行う予定。
[Preface] We have a simple and easy way to control sperm, sperm, DNA, direct injection, DNA injection, sperm and mating, exogenous DNA, sperm and fetal DNA. The results showed that the alien DNA could be fertilized at a high rate (50-90%) and reached the egg side (F0 generation). The alien DNA could be found in 1 cell when the number of copies was less than 1. In this paper, we discuss the increase of the number of introduced genes and the possibility of their occurrence in the market. [Methods] To investigate the effects of different factors such as FuGENE6(Boehringer Mannheim), Transfectam(Promega), SuperFect(Qiagen), Effecten(Qiagen), CaPO4 transfection kit(Stratagene), DEAE-dextran(Stratagene), Lipofectin(GIBCO BRL). Exogenous DNA is used as a direct chain pCAGGS-lacZ[reporter gene]. The concentration of injected DNA is 4μg/testes. The quantity of imported test products and the manufacturer's protocol shall be determined. ICR DNA injection method (Sato et al., 1998, 1999). After injection, PMSG-hCG was injected into B6C3F1 female at the 2nd and 3rd day. After mating, E12.4 was opened, yolk sac DNA analysis (PCR-Southern analysis and genomic Southern analysis), head X-Gal staining, and body RNA analysis (RT-PCR analysis) were performed. [Results/Outlook] PCR-Southern analysis was performed to evaluate the efficacy of F0 fetal DNA transfer at 40-100% of the target population. Special, Transfectam, DEAE-dextran are generally higher copies and the import pattern is shown. , import copy number The number of individuals detected by RT-PCR was increased, and the number of individuals detected by RT-PCR was increased. (Sato et al., Transgenics,in press)。This article introduces the application of the new method to improve the quality of the products. In addition, a minimum of 3 rounds of DNA/DNA gene introduction test complex sperm injection, a maximum of 5 copies/diploid cell gene introduction success, and future multiple rounds of DNA/DNA gene introduction test complex sperm injection are scheduled.

项目成果

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专著数量(0)
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会议论文数量(0)
专利数量(0)
M.Sato: "Sperm-mediated gene transfer by direct injection of foreign DNA into mouse testis" Transgenics. (in press).
M.Sato:“通过将外源 DNA 直接注射到小鼠睾丸中来进行精子介导的基因转移” Transgenics。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
M.Sato: "Testis-mediated gene transfer (TMGT) in mice: Successful transmission of introduced DNA from F0 to F2 generations." Transgenics. (in press).
M.Sato:“小鼠睾丸介导的基因转移 (TMGT):导入的 DNA 从 F0 代成功传递到 F2 代。”
  • DOI:
  • 发表时间:
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    0
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  • 通讯作者:
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