蛍光タンパク質GFP遺伝子標識法を用いた細菌細胞の植物根-土壌系での高感度検出

荧光蛋白GFP基因标记法高灵敏检测植物根-土系统中细菌细胞

• 批准号: 08760061
• 负责人: 境 雅夫
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760061/
• 关键词: 植物根圏; GFP; Pseudomonas; トランスポゾン

有用根圏細菌の接種効果を向上させるためには,十分な根圏定着を実現することが重要であり,従って根圏における細菌の生態・挙動を十分に把握しておく必要がある。しかし,根圏における細菌の挙動解析に適した研究手法がないため,植物根への移動・定着プロセスに関する知見はまだ少なく,有用細菌の根圏接種技術への応用も不十分である。そこで,本研究では根圏における特定細菌の挙動を把握するため,蛍光タンパク質(GFP;Green Fluorescent Protein)遺伝子による標識と検出を検討した。標識した細菌細胞の根圏微小部位での挙動を直接解析するためのマーカーとして,発光クラゲ(Aequorea Victoria)の蛍光タンパク質GFPを用いた。GFPは238個のアミノ酸からなる特異なタンパク質であり,蛍光に関与する発色団のトリプチドを自身のアミノ酸配列中に持っているため,蛍光検出のための基質,cofactorをなんら必要としない。上記のGFP遺伝子で根圏細菌を標識するため,Tn5由来のミニトランスポゾンベクターによって細菌染色体に導入するシステムを用いた。このベクターの転移領域は転移に必要なトランスポザ-ゼがトランスに供給され,転移領域自身にはトランスポザ-ゼがコードされていないため,細菌染色体への転移後は安定で再転移などは生じない。GFP遺伝子をこの転移領域中にConstitutiveに発現するように挿入したプラスミドを作製し,根圏から分離した根圏定着能の高い数種のPseudomonas属細菌に接合伝達法により導入した結果,GFP遺伝子は染色体中に組み込まれ,十分に発現した。GFP標識細菌を土壌や植物根圏に接種し,微小部位での直接検鏡を用いて行った結果,GFP標識細菌細胞の形態,数,分布状態の高感度検出が可能であった。

The inoculation of useful bacteria in the rhizosphere is very important, and the ecology of bacteria in the rhizosphere is very important. In addition, the study method of bacterial movement analysis in root system is very suitable, and the knowledge of plant root system movement and fixation is very small, and the application method of bacterial inoculation technology in root system is not very good. In this study, we investigated the identification and detection of GFP (Green Fluorescent Protein) gene in the presence of specific bacteria. Identification of micro-site of bacterial cells and its direct analysis of the fluorescence of GFP GFP has 238 unique amino acids, and its cofactor is essential for the development of its own amino acid sequence. Note that GFP gene is used in the identification of bacteria in the root system. The bacterial chromosome is stable after the bacterial chromosome is transferred, and then it is transferred again. The GFP gene was introduced into the genome of several Pseudomonas species with high ability to isolate and isolate the rhizosphere. As a result, the GFP gene was found in the chromosome. GFP identifies bacteria in soil and plant root circles. Direct microscopy of minute parts of the bacteria indicates that high sensitivity to morphology, number and distribution of GFP identifies bacteria cells is possible.