蛍光タンパク質GFP遺伝子標識法を用いた細菌細胞の植物根-土壌系での高感度検出

有用根圏細菌の接種効果を向上させるためには,十分な根圏定着を実現することが重要であり,従って根圏における細菌の生態・挙動を十分に把握しておく必要がある。しかし,根圏における細菌の挙動解析に適した研究手法がないため,植物根への移動・定着プロセスに関する知見はまだ少なく,有用細菌の根圏接種技術への応用も不十分である。そこで,本研究では根圏における特定細菌の挙動を把握するため,蛍光タンパク質(GFP;Green Fluorescent Protein)遺伝子による標識と検出を検討した。標識した細菌細胞の根圏微小部位での挙動を直接解析するためのマーカーとして,発光クラゲ(Aequorea Victoria)の蛍光タンパク質GFPを用いた。GFPは238個のアミノ酸からなる特異なタンパク質であり,蛍光に関与する発色団のトリプチドを自身のアミノ酸配列中に持っているため,蛍光検出のための基質,cofactorをなんら必要としない。上記のGFP遺伝子で根圏細菌を標識するため,Tn5由来のミニトランスポゾンベクターによって細菌染色体に導入するシステムを用いた。このベクターの転移領域は転移に必要なトランスポザ-ゼがトランスに供給され,転移領域自身にはトランスポザ-ゼがコードされていないため,細菌染色体への転移後は安定で再転移などは生じない。GFP遺伝子をこの転移領域中にConstitutiveに発現するように挿入したプラスミドを作製し,根圏から分離した根圏定着能の高い数種のPseudomonas属細菌に接合伝達法により導入した結果,GFP遺伝子は染色体中に組み込まれ,十分に発現した。GFP標識細菌を土壌や植物根圏に接種し,微小部位での直接検鏡を用いて行った結果,GFP標識細菌細胞の形態,数,分布状態の高感度検出が可能であった。

有用根圏細菌の接種効果を向上させるためには,十分な根圏定着を実現することが重要であり,従って根圏における細菌の生態・挙動を十分に把握しておく必要がある。しかし,根圏における細菌の挙動解析に適した研究手法がないため,植物根への移動・定着プロセスに関する知見はまだ少なく,有用細菌の根圏接種技術への応用も不十分である。そこで,本研究では根圏における特定細菌の挙動を把握するため,蛍光タンパク質(GFP;Green Fluorescent Protein)遺伝子による標識と検出を検討した。標識した細菌細胞の根圏微小部位での挙動を直接解析するためのマーカーとして,発光クラゲ(Aequorea Victoria)の蛍光タンパク質GFPを用いた。GFPは238個のアミノ酸からなる特異なタンパク質であり,蛍光に関与する発色団のトリプチドを自身のアミノ酸配列中に持っているため,蛍光検出のための基質,cofactorをなんら必要としない。上記のGFP遺伝子で根圏細菌を標識するため,Tn5由来のミニトランスポゾンベクターによって細菌染色体に導入するシステムを用いた。このベクターの転移領域は転移に必要なトランスポザ-ゼがトランスに供給され,転移領域自身にはトランスポザ-ゼがコードされていないため,細菌染色体への転移後は安定で再転移などは生じない。GFP遺伝子をこの転移領域中にConstitutiveに発現するように挿入したプラスミドを作製し,根圏から分離した根圏定着能の高い数種のPseudomonas属細菌に接合伝達法により導入した結果,GFP遺伝子は染色体中に組み込まれ,十分に発現した。GFP標識細菌を土壌や植物根圏に接種し,微小部位での直接検鏡を用いて行った結果,GFP標識細菌細胞の形態,数,分布状態の高感度検出が可能であった。