ウニ胚における細胞接着性ペプチド受容体蛋白(FR-1受容体)遺伝子発現

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(1)抗FR-1受容体抗体の特異性: FR-1受容体はArg-Gly-Asp-Ser (RGDS)アミノ酸配列を持つ合成ペプチドと特異的に結合することから、この合成ペプチドをアフィニテイーカラムに結合してタコノマクラ間充織胞胚から分離・精製して、それを抗原とする抗血清をウサギで調整した。全胚分画から調整した試料を用いて行ったイムノブロッティングから、この抗血清は特異的にFR-1受容体蛋白のみを識別することが示された。この抗血清を用いて行った免疫組織化学から、既に発表したRGDS結合活性を持っているFR-1受容体の分布とほとんど同一の組織分布ではあったが、一部異なった部域にもFR-1受容体蛋白があることが明らかになった。(2)FR-1受容体蛋白cDNAスクリーニング: バフンウニ原腸胚全mRNAから作成したcDNAをλ gt11ウイルスに組み込み作成したcDNAライブラリーを大腸菌に感染させて、cDNAから発現されるウニ原腸胚蛋白を上記抗FR-1受容体抗血清を用いて免疫化学的にスクリーニングした。その結果最初A2aからC3mまでの38個のクローンを得ることができた。その中からC2iクローンを選んでさらに3回スクリーニングを行った後、λ gt11を感染させた大腸菌を大容量の液体培養に切り替え、ウイルスDNAを回収し、ここからPCRを行ってEcoR1制限酵素処理に備えた量のDNAを得た。その結果約1Kbpの大きさのDNA断片を得た。今後はこの部分のシークエンスを行い、その一部分を用いてmRNAプロープ用に合成して5'-XRITCで標識して組織分布検索用合成DNAを作成し、一方、同じcDNA部分に5'-ビオチンを標識した合成DNAを作成してノーザンブロッティングを行う予定である。