テンプレートによるタンパク質結晶の核形成の促進とマイクロ流体デバイスへの応用

今年度は、基板上に形成させたテンプレートによるタンパク質結晶の核形成促進を目的として、昨年度設計した試作型デバイスを用いて、脂質二重膜をテンプレートにしたタンパク質の結晶化に着手した。さらに、その結果を基にしてマイクロ流体デバイスへの応用を試みた。試作型デバイスは、金薄膜を蒸着したガラス基板上にリソグラフィー技術によってSU-8製のマイクロウェルを作製した。マイクロウェル上に脂質二重膜を形成させ、その上にHisタグ付きタンパク質を固定化してテンプレートを作製した。結晶化に最適なテンプレートを作製するために、溶液濃度や脂質二重膜の条件、固定化時間などを検討した。Hisタグ付きGFPをモデルタンパク質として結晶化実験を行った。脂質の種類、脂質の混合比について検討を行った結果、Hisタグ付きGFPを固定するための脂質濃度が高くなるにつれて、GFPの結晶が析出しにくくなることが分かった。一方で、脂質の混合比を調整して、hisタグ付きタンパク質の濃度を低下させると、液滴中に多数の結晶の析出が観測された。これらの結果から、テンプレートであるHisタグ付きタンパク質の固定化密度が結晶化挙動に影響を与えていることが示唆された。次に、本年度の目標であるマイクロ流体デバイスへの応用を行った。マイクロデバイスでは、1条件あたりに必要な結晶化溶液の体積は約30 nLであり、試作型と比較すると30~40分の1程度のサンプル量で結晶化が可能であった。また、単位体積あたりの結晶数を従来法や試作型デバイスと比較すると、析出した結晶数が劇的に増加することが明らかとなった。これらの結果から、マイクロ流体デバイスと脂質二重膜-Hisタグ付きタンパク質を用いた結晶化手法は、タンパク質の核形成を促進させる可能性が見出された。

今年度は、基板上に形成させたテンプレートによるタンパク質結晶の核形成促進を目的として、昨年度設計した試作型デバイスを用いて、脂質二重膜をテンプレートにしたタンパク質の結晶化に着手した。さらに、その結果を基にしてマイクロ流体デバイスへの応用を試みた。試作型デバイスは、金薄膜を蒸着したガラス基板上にリソグラフィー技術によってSU-8製のマイクロウェルを作製した。マイクロウェル上に脂質二重膜を形成させ、その上にHisタグ付きタンパク質を固定化してテンプレートを作製した。結晶化に最適なテンプレートを作製するために、溶液濃度や脂質二重膜の条件、固定化時間などを検討した。Hisタグ付きGFPをモデルタンパク質として結晶化実験を行った。脂質の種類、脂質の混合比について検討を行った結果、Hisタグ付きGFPを固定するための脂質濃度が高くなるにつれて、GFPの結晶が析出しにくくなることが分かった。一方で、脂質の混合比を調整して、hisタグ付きタンパク質の濃度を低下させると、液滴中に多数の結晶の析出が観測された。これらの結果から、テンプレートであるHisタグ付きタンパク質の固定化密度が結晶化挙動に影響を与えていることが示唆された。次に、本年度の目標であるマイクロ流体デバイスへの応用を行った。マイクロデバイスでは、1条件あたりに必要な結晶化溶液の体積は約30 nLであり、試作型と比較すると30~40分の1程度のサンプル量で結晶化が可能であった。また、単位体積あたりの結晶数を従来法や試作型デバイスと比較すると、析出した結晶数が劇的に増加することが明らかとなった。これらの結果から、マイクロ流体デバイスと脂質二重膜-Hisタグ付きタンパク質を用いた結晶化手法は、タンパク質の核形成を促進させる可能性が見出された。