テンプレートによるタンパク質結晶の核形成の促進とマイクロ流体デバイスへの応用

模板促进蛋白质晶体成核及其在微流控器件中的应用

基本信息

批准号：
13J07016
负责人：
真栄城正寿
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Hokkaido University (2014)Kyushu University (2013)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、基板上に形成させたテンプレートによるタンパク質結晶の核形成促進を目的として、昨年度設計した試作型デバイスを用いて、脂質二重膜をテンプレートにしたタンパク質の結晶化に着手した。さらに、その結果を基にしてマイクロ流体デバイスへの応用を試みた。試作型デバイスは、金薄膜を蒸着したガラス基板上にリソグラフィー技術によってSU-8製のマイクロウェルを作製した。マイクロウェル上に脂質二重膜を形成させ、その上にHisタグ付きタンパク質を固定化してテンプレートを作製した。結晶化に最適なテンプレートを作製するために、溶液濃度や脂質二重膜の条件、固定化時間などを検討した。Hisタグ付きGFPをモデルタンパク質として結晶化実験を行った。脂質の種類、脂質の混合比について検討を行った結果、Hisタグ付きGFPを固定するための脂質濃度が高くなるにつれて、GFPの結晶が析出しにくくなることが分かった。一方で、脂質の混合比を調整して、hisタグ付きタンパク質の濃度を低下させると、液滴中に多数の結晶の析出が観測された。これらの結果から、テンプレートであるHisタグ付きタンパク質の固定化密度が結晶化挙動に影響を与えていることが示唆された。次に、本年度の目標であるマイクロ流体デバイスへの応用を行った。マイクロデバイスでは、1条件あたりに必要な結晶化溶液の体積は約30 nLであり、試作型と比較すると30~40分の1程度のサンプル量で結晶化が可能であった。また、単位体積あたりの結晶数を従来法や試作型デバイスと比較すると、析出した結晶数が劇的に増加することが明らかとなった。これらの結果から、マイクロ流体デバイスと脂質二重膜-Hisタグ付きタンパク質を用いた結晶化手法は、タンパク質の核形成を促進させる可能性が見出された。

今年，为了使用脂质双层膜促进蛋白质晶体的成核，我们开始使用去年设计的原型设备来结晶蛋白质。此外，根据结果，我们尝试将其应用于微流体设备。原型设备是通过光刻制备的，上面是玻璃基板上沉积薄金膜的玻璃基板。在微孔上形成了脂质双层，并将其标记的蛋白固定在其上创建模板。为了准备最佳的结晶模板，检查了溶液浓度，脂质双层膜的条件和固定时间。使用HIS标记的GFP作为模型蛋白进行结晶实验。由于检查了脂质的类型和脂质的比率，因此发现，随着固定HIS标记GFP的脂质浓度的增加，GFP晶体的沉淀可能较小。另一方面，当调整脂质混合比以降低其标记蛋白的浓度时，观察到大量晶体沉淀在液滴中。这些结果表明，模板His标记蛋白的固定密度会影响结晶行为。接下来，我们将今年的目标应用于微流体设备。在微电位中，每个条件所需的结晶溶液的体积约为30 nL，并且可以用样本量约为30至40个原型的结晶。此外，当比较单位体积的晶体数量与常规方法或原型设备时，已经发现晶体的数量会大大增加。这些结果表明，使用微流体设备和脂质双层标记的蛋白质结晶技术可能会促进蛋白质成核。