テンプレートによるタンパク質結晶の核形成の促進とマイクロ流体デバイスへの応用

模板促进蛋白质晶体成核及其在微流控器件中的应用

• 批准号: 13J07016
• 负责人: 真栄城 正寿
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Hokkaido University (2014)Kyushu University (2013)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J07016/
• 关键词: マイクロ流体デバイス; タンパク質; 結晶化; 脂質二重膜; マクロ流体デバイス

今年度は、基板上に形成させたテンプレートによるタンパク質結晶の核形成促進を目的として、昨年度設計した試作型デバイスを用いて、脂質二重膜をテンプレートにしたタンパク質の結晶化に着手した。さらに、その結果を基にしてマイクロ流体デバイスへの応用を試みた。試作型デバイスは、金薄膜を蒸着したガラス基板上にリソグラフィー技術によってSU-8製のマイクロウェルを作製した。マイクロウェル上に脂質二重膜を形成させ、その上にHisタグ付きタンパク質を固定化してテンプレートを作製した。結晶化に最適なテンプレートを作製するために、溶液濃度や脂質二重膜の条件、固定化時間などを検討した。Hisタグ付きGFPをモデルタンパク質として結晶化実験を行った。脂質の種類、脂質の混合比について検討を行った結果、Hisタグ付きGFPを固定するための脂質濃度が高くなるにつれて、GFPの結晶が析出しにくくなることが分かった。一方で、脂質の混合比を調整して、hisタグ付きタンパク質の濃度を低下させると、液滴中に多数の結晶の析出が観測された。これらの結果から、テンプレートであるHisタグ付きタンパク質の固定化密度が結晶化挙動に影響を与えていることが示唆された。次に、本年度の目標であるマイクロ流体デバイスへの応用を行った。マイクロデバイスでは、1条件あたりに必要な結晶化溶液の体積は約30 nLであり、試作型と比較すると30~40分の1程度のサンプル量で結晶化が可能であった。また、単位体積あたりの結晶数を従来法や試作型デバイスと比較すると、析出した結晶数が劇的に増加することが明らかとなった。これらの結果から、マイクロ流体デバイスと脂質二重膜-Hisタグ付きタンパク質を用いた結晶化手法は、タンパク質の核形成を促進させる可能性が見出された。

This year, the formation of a thin film on a substrate and the promotion of the formation of a thin film on a substrate are discussed. For example, if you want to use a computer, you can use it. The test type of film is evaporated on the substrate. The technology of SU-8 is used to manufacture the film. The formation of lipid double membrane on the surface of the membrane and the immobilization of the lipid double membrane on the surface of the membrane The optimum conditions for crystallization, solution concentration, lipid double membrane and immobilization time were discussed. His name is GFP. The type of lipid, the mixing ratio of lipid, the concentration of lipid, and the precipitation of GFP crystals were investigated. On the one hand, the mixing ratio of lipids is adjusted, the concentration of lipids is reduced, and most of the crystals in the droplets are precipitated. The result is that the crystallization density of the crystalline material is affected by the crystallization temperature. This year's goal is to improve the quality of products. The volume of the crystallization solution is about 30 nL, and the crystallization is possible under the conditions of 30~40 min for the test type. The number of crystals per unit is increasing. The possibility of promoting the formation of lipid double membrane by crystallization technique is shown.

项目成果

マイクロ流体デバイスを用いた好冷細菌Pseudoalterommonas sp. AS-131由来グルコキナーゼ結晶のシーディング

使用微流体装置接种来自嗜冷细菌 Pseudoalteromonas sp. AS-131 的葡萄糖激酶晶体。

• 发表时间: 2013
• 作者: 真栄城正寿;湧川盛洋;Ashtamurthy Pawate;山下健一;Paul J. A. Kenis;宮崎真佐也;渡邉啓一
• 通讯作者: 渡邉啓一

マイクロ空間を用いる晶析制御

利用微空间进行结晶控制

• 发表时间: 2013
• 作者: Yamazaki;A.;T. Watanabe;U. Tsunogai;H. Hasegawa;and H. Yamano;真栄城正寿
• 通讯作者: 真栄城正寿

マイクロ流体デバイスによるタンパク質の結晶化制御技術

利用微流控装置的蛋白质结晶控制技术

• 发表时间: 2014
• 作者: 真栄城正寿，Ashtamurthy S. Pawate;渡邉啓一;渡慶次学;Paul J. A. Kenis;宮崎真佐也
• 通讯作者: 宮崎真佐也

マイクロ流体デバイスを用いたタンパク質結晶のシーディング

使用微流体装置接种蛋白质晶体

• 发表时间: 2013
• 作者: 真栄城正寿;湧川盛洋;Ashtamurthy Pawate;山下健一;渡邉啓一;Paul J. A. Kenis;宮崎真佐也
• 通讯作者: 宮崎真佐也

Crystallization of Glucokinase from Psychrophilic Pseudoalteromonas sp. AS-131 in Microfluidic Chip and Its Application for On-chip X-ray Diffraction

嗜冷假交替单胞菌中葡萄糖激酶的结晶。

• 发表时间: 2013
• 作者: Masaya Miyazaki;Masatoshi Maeki;Ashtamurthy S. Pawate;Morihiro Wakugawa;Kenichi Yamashita;Keiichi Watanabe;Paul J. A. Kenis
• 通讯作者: Paul J. A. Kenis