クリプトスポリジウム原虫のセントロメア配列の同定とそれを用いた遺伝子導入法の確立

クリプトスポリジウムのセントロメア配列を決定し、この配列を組み込んだ人工染色体を用いてクリプトスポリジウムの遺伝子導入法の確立を行うことが、本研究の目標である。昨年度までのデータから、本原虫は繰り返し配列やAT-richなど、典型的なセントロメアの配列を持たないことが明らかとなった。そこで本年度は他の生物において既知の様々なヒストン修飾が本原虫に存在するか網羅的に調査し、本原虫の転写制御を詳細に調べ、セントロメアに関わるヒストン修飾を探索することを目的とした。本原虫のスポロゾイトステージでは、転写を活性化させるヒストンH3のメチル化およびアセチル化修飾のシグナルが、ヒストン修飾特異的な抗体を用いたウエスタンブロットによって検出された。更に、その修飾は細胞内ステージにおいても確認され、核に局在していた。そのため、この修飾は原虫の生存に関わる重要な修飾であることが示唆された。本原虫のヒストンメチル化修飾酵素に必須のSETドメインの系統樹を作成した所、本原虫を含むアピコンプレクサは、宿主である哺乳類が持つSETドメインと系統的に大きく離れていたため、薬剤標的として期待されることが明らかとなった。対して、遺伝子発現の抑制に関わるとされているヒストン修飾はヒストンH3については検出することはできなかった。これは、本原虫のスポロゾイトステージにおいて転写を抑制するヒストン修飾の量が非常に少ない事を示唆している。しかし、ヒストンH4において、転写の抑制およびヘテロクロマチン領域に関与すると予測されている修飾を検出したため、この修飾特異的な抗体を用いてChIP-seqを行うことにより本原虫のヘテロクロマチン領域を検出し、セントロメア領域を推定することができることが示唆された。

クリプトスポリジウムのセントロメア配列を決定し、この配列を組み込んだ人工染色体を用いてクリプトスポリジウムの遺伝子導入法の確立を行うことが、本研究の目標である。昨年度までのデータから、本原虫は繰り返し配列やAT-richなど、典型的なセントロメアの配列を持たないことが明らかとなった。そこで本年度は他の生物において既知の様々なヒストン修飾が本原虫に存在するか網羅的に調査し、本原虫の転写制御を詳細に調べ、セントロメアに関わるヒストン修飾を探索することを目的とした。本原虫のスポロゾイトステージでは、転写を活性化させるヒストンH3のメチル化およびアセチル化修飾のシグナルが、ヒストン修飾特異的な抗体を用いたウエスタンブロットによって検出された。更に、その修飾は細胞内ステージにおいても確認され、核に局在していた。そのため、この修飾は原虫の生存に関わる重要な修飾であることが示唆された。本原虫のヒストンメチル化修飾酵素に必須のSETドメインの系統樹を作成した所、本原虫を含むアピコンプレクサは、宿主である哺乳類が持つSETドメインと系統的に大きく離れていたため、薬剤標的として期待されることが明らかとなった。対して、遺伝子発現の抑制に関わるとされているヒストン修飾はヒストンH3については検出することはできなかった。これは、本原虫のスポロゾイトステージにおいて転写を抑制するヒストン修飾の量が非常に少ない事を示唆している。しかし、ヒストンH4において、転写の抑制およびヘテロクロマチン領域に関与すると予測されている修飾を検出したため、この修飾特異的な抗体を用いてChIP-seqを行うことにより本原虫のヘテロクロマチン領域を検出し、セントロメア領域を推定することができることが示唆された。