ゲノム安定性維持に関わるユビキチンリガーゼＣＲＬ４‐Ｃｄｔ２の活性制御機構の解析

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本研究は、ゲノム安定性維持に重要なユビキチンリガーゼCRL4-Cdt2が、どのようにS期のクロマチン上でのみ機能するか、その分子機構の解明を目指し、PCNAのDNAへのローディングがCRL4-Cdt2や基質の集合とユビキチン化活性を制御する可能性を検証してきた。今年度は、1.DNA結合PCNAへのCRL4-Cdt2、基質Cdt1の分子集合過程を詳細に解析し、2.他の活性制御因子の探索を行った。1. Cdt2のC末端にPIPボックスが見つかったので、CRL4-Cdt2(PIP変異体)を精製し、DNAビーズを用いてプルダウンした。その結果、Cdt2のPIP変異体ではDNA結合PCNAへの結合が抑制された。また、Cdt2のDNA結合PCNAへの結合は、基質の有無で変化しなかった。これまで、Cdt2はN末端のWD40リピートを介して基質-PCNA複合領域を認識すると考えられてきたが、Cdt2のPIPボックスを介したPCNAへの結合によって、基質-PCNAの結合を必要としないことが明らかとなった。また、DNAなしではCdt2はPCNAとほとんど結合しなかったことから、PCNAのDNAへのロードが、基質とCdt2の集合に必須の過程であることが示された。2. 特異的E2が CRL4-Cdt2のポリユビキチン化能を促進する可能性を検討するため、32種の精製E2を購入し、in vitroユビキチン化反応でスクリーニングした。その結果、これまで使用してきたUbcH5cより活性が高いE2候補をいくつか得た。現在、細胞内で基質分解に関与するかをsiRNAによって検討している。本研究では、PCNAのロードが基質、Cdt2がDNA上へ集合、ユビキチン化するために必須であることを直接証明した。加えて、さらなるユビキチン化促進因子の可能性も見出した。