細胞分化運命決定の遺伝子選択メカニズムの解明

本年度は、H3.3と結合する分化責任因子の同定を試みた。内在性H3.3抗体による因子の同定と外来性のGFP-H3.3と結合する因子との2パターンを用いて共通する因子を探し出すことを予定していたが、ヒストン修飾状態に依存しないGFPタグを利用することにより結合タンパク質を網羅的に同定することを優先させた。遺伝子集積が起こっている未分化段階におけるH3.3-GFP発現C2C12細胞を大量に用意し、細胞質およびヌクレオソーム画分を抽出し、GFP抗体により複合体精製を行った。次に、質量分析計により構成タンパク質の同定を試みた結果、細胞質画分ではヒストンシャペロンがヌクレオソーム画分ではヒストン脱アセチル化酵素が多く検出されたものの大半が機能既知のものであった。現在は、得られた質量分析データを詳細に検証し、新規機能を持ちそうな候補因子を精査中である。質量分析解析の際に、複数の未知ヒストンバリアントが存在することが示唆された。その後の調査から、マウス未知ヒストンH3バリアント14種類、ヒト3種類を新たに同定した。(Epigenetics & Chromatin, 2015)。これら様々なヒストンH3バリアントが、骨格筋分化におけるジーンクラスタリングを介した選択的な遺伝子の転写制御に必要であることを示唆しており、当初の計画より複雑化していることが明らかとなった。そこで、本研究課題の成果は、研究会のシンポジウムおよび雑誌の執筆等で発表を行った。さらに、平成27年度より科学研究費補助金若手Bの研究課題「骨格筋分化における新規ヒストンH3バリアントH3mm7の遺伝子選択機構の解明」に取り組んでおり、今後、これらヒストンH3バリアントの骨格筋分化におけるジーンクラスタリングを介した選択的な遺伝子の転写制御機構の解明も行っていく予定である。

本年度は、H3.3と結合する分化責任因子の同定を試みた。内在性H3.3抗体による因子の同定と外来性のGFP-H3.3と結合する因子との2パターンを用いて共通する因子を探し出すことを予定していたが、ヒストン修飾状態に依存しないGFPタグを利用することにより結合タンパク質を網羅的に同定することを優先させた。遺伝子集積が起こっている未分化段階におけるH3.3-GFP発現C2C12細胞を大量に用意し、細胞質およびヌクレオソーム画分を抽出し、GFP抗体により複合体精製を行った。次に、質量分析計により構成タンパク質の同定を試みた結果、細胞質画分ではヒストンシャペロンがヌクレオソーム画分ではヒストン脱アセチル化酵素が多く検出されたものの大半が機能既知のものであった。現在は、得られた質量分析データを詳細に検証し、新規機能を持ちそうな候補因子を精査中である。質量分析解析の際に、複数の未知ヒストンバリアントが存在することが示唆された。その後の調査から、マウス未知ヒストンH3バリアント14種類、ヒト3種類を新たに同定した。(Epigenetics & Chromatin, 2015)。これら様々なヒストンH3バリアントが、骨格筋分化におけるジーンクラスタリングを介した選択的な遺伝子の転写制御に必要であることを示唆しており、当初の計画より複雑化していることが明らかとなった。そこで、本研究課題の成果は、研究会のシンポジウムおよび雑誌の執筆等で発表を行った。さらに、平成27年度より科学研究費補助金若手Bの研究課題「骨格筋分化における新規ヒストンH3バリアントH3mm7の遺伝子選択機構の解明」に取り組んでおり、今後、これらヒストンH3バリアントの骨格筋分化におけるジーンクラスタリングを介した選択的な遺伝子の転写制御機構の解明も行っていく予定である。