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人為的複製起点を用いた高等真核生物Ｍｃｍ２－７挙動のダイナミズムの解明

使用人工复制起点阐明高等真核生物中 Mcm2-7 行为的动态

基本信息

批准号：
13J01818
负责人：
讃岐陽介
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、高等真核生物のDNA複製を試験管内で再現できる唯一の実験系であるツメガエル卵無細胞複製系を用いて配列特異的複製起点の構築を試み、GAL4結合ドメインを融合したCdc6をGAL4結合配列特異的にプラスミドに結合させ、内在Cdc6を除いた卵抽出液内で反応させることで、DNA配列特異的にpre-RCを構築し、DNA複製を開始することに成功した。さらに配列特異的複製起点には、複製開始前から不活性な状態で結合しているDNAヘリカーゼの本体Mcm2-7に加えてCdc45、DNAポリメラーゼα、さらに高等真核生物特有な複製因子であるRecQ4とTreslinが結合することを見いだした。RecQ4は、これまで卵無細胞複製系においてCdc45などのDNA結合には必要がないが、複製開始に必要であることが報告されている。そこで卵抽出液からRecQ4を除き、配列特異的複製起点への複製因子の結合を調べたところ、RecQ4の除去により複製開始反応やDNAポリメラーゼαの結合は抑制されたが、Cdc45の配列特異的複製起点への結合には影響しなかった。さらにRecQ4を除去してもDNA上にDNAヘリカーゼの本体であるCMG複合体の構成因子は強固に結合している事を見いだした。また二重鎖DNAの開裂を検出するP1ヌクレアーゼ解析を試み、RecQ4除去によりDNA複製時の二重鎖の開裂が抑制されることを示した。これらの結果は、高等真核生物のDNA複製時にRecQ4がCMG複合体を活性化して二本鎖開裂を開始する反応を促進することを示唆するものである。これらの成果は、高等真核生物における複製開始の分子機構解明に大きく貢献すると考えられる。

In this study, DNA replication in higher eukaryotes was tested in vitro. The unique system was used to construct a pair-specific origin of replication. GAL4 binding sites were fused. Cdc6 binding sites were fused to GAL4 binding sites. DNA replication begins The origin of replication-specific DNA sequence is not active until the start of replication. DNA sequence is not active until the start of replication. DNA sequence is not active until the start of replication. DNA sequence is not active until the start of replication. RecQ4 is required for DNA binding in an egg-free cell division line. In addition, the deletion of RecQ4 from egg extracts and the binding of replication factors to sequence-specific replication origins are regulated and inhibited by the deletion of RecQ4 and the binding of replication factors to sequence-specific replication origins such as Cdc45. In addition, the CMG complex is composed of four components: The double lock DNA cleavage was detected by PCR and analyzed by RecQ4. The double lock DNA cleavage was inhibited by PCR. As a result, RecQ4 and CMG complexes are activated during DNA replication in higher eukaryotes. The results of this study are as follows: (1) The molecular mechanism of replication in higher eukaryotes has been greatly contributed to the elucidation of replication in eukaryotes.