人為的複製起点を用いた高等真核生物Ｍｃｍ２－７挙動のダイナミズムの解明

本研究では、高等真核生物のDNA複製を試験管内で再現できる唯一の実験系であるツメガエル卵無細胞複製系を用いて配列特異的複製起点の構築を試み、GAL4結合ドメインを融合したCdc6をGAL4結合配列特異的にプラスミドに結合させ、内在Cdc6を除いた卵抽出液内で反応させることで、DNA配列特異的にpre-RCを構築し、DNA複製を開始することに成功した。さらに配列特異的複製起点には、複製開始前から不活性な状態で結合しているDNAヘリカーゼの本体Mcm2-7に加えてCdc45、DNAポリメラーゼα、さらに高等真核生物特有な複製因子であるRecQ4とTreslinが結合することを見いだした。RecQ4は、これまで卵無細胞複製系においてCdc45などのDNA結合には必要がないが、複製開始に必要であることが報告されている。そこで卵抽出液からRecQ4を除き、配列特異的複製起点への複製因子の結合を調べたところ、RecQ4の除去により複製開始反応やDNAポリメラーゼαの結合は抑制されたが、Cdc45の配列特異的複製起点への結合には影響しなかった。さらにRecQ4を除去してもDNA上にDNAヘリカーゼの本体であるCMG複合体の構成因子は強固に結合している事を見いだした。また二重鎖DNAの開裂を検出するP1ヌクレアーゼ解析を試み、RecQ4除去によりDNA複製時の二重鎖の開裂が抑制されることを示した。これらの結果は、高等真核生物のDNA複製時にRecQ4がCMG複合体を活性化して二本鎖開裂を開始する反応を促進することを示唆するものである。これらの成果は、高等真核生物における複製開始の分子機構解明に大きく貢献すると考えられる。

本研究では、高等真核生物のDNA複製を試験管内で再現できる唯一の実験系であるツメガエル卵無細胞複製系を用いて配列特異的複製起点の構築を試み、GAL4結合ドメインを融合したCdc6をGAL4結合配列特異的にプラスミドに結合させ、内在Cdc6を除いた卵抽出液内で反応させることで、DNA配列特異的にpre-RCを構築し、DNA複製を開始することに成功した。さらに配列特異的複製起点には、複製開始前から不活性な状態で結合しているDNAヘリカーゼの本体Mcm2-7に加えてCdc45、DNAポリメラーゼα、さらに高等真核生物特有な複製因子であるRecQ4とTreslinが結合することを見いだした。RecQ4は、これまで卵無細胞複製系においてCdc45などのDNA結合には必要がないが、複製開始に必要であることが報告されている。そこで卵抽出液からRecQ4を除き、配列特異的複製起点への複製因子の結合を調べたところ、RecQ4の除去により複製開始反応やDNAポリメラーゼαの結合は抑制されたが、Cdc45の配列特異的複製起点への結合には影響しなかった。さらにRecQ4を除去してもDNA上にDNAヘリカーゼの本体であるCMG複合体の構成因子は強固に結合している事を見いだした。また二重鎖DNAの開裂を検出するP1ヌクレアーゼ解析を試み、RecQ4除去によりDNA複製時の二重鎖の開裂が抑制されることを示した。これらの結果は、高等真核生物のDNA複製時にRecQ4がCMG複合体を活性化して二本鎖開裂を開始する反応を促進することを示唆するものである。これらの成果は、高等真核生物における複製開始の分子機構解明に大きく貢献すると考えられる。