HEMATOPOIETIC SECRETION USING 3 PHOTON MICROSCOPY OF SEROTONIN AUTOFLUORESCENCE

海报给出的细胞成像生物研究和 药物开发会议（剑桥健康技术研究所，12-14 1998年11月，圣地亚哥）荧光的多光子（Multi-photon，λ）激发 是基于多个光子可以相互作用的原理 “同时”与荧光团，从而增加他们的能量， 激发一个转变， 光子（Denk 1990;威廉姆斯1994; Denk 1995; Xu 1996; Xu 1996）。 5-羟色胺吸收带存在于小于250 nm的波长处;因此 2 P和3 P吸收峰预计分别在~ 500和~700 nm处。 在光激发之后，血清素分子振动地松弛 通过环境的相互作用释放出一个荧光光子 其能量小于所吸收的总能量（~340 nm）。 在这些成像研究中，我们利用低能量红色光子（740 nm） 和三光子机制来激活天然血清素 荧光。 红光3 P激发增强了对深紫外的需求 光学及其相关的像差和低透射率。 非线性激发也本质上局限于焦点 平面和 因此可能比单光子技术侵入性更小。 我们 先前已经表明，3 P显微镜下的马槟榔颗粒， RBL-2 H3细胞是可能的（Maiti 1997）。 这里我们报告3 P成像 测量那些经历抗原刺激分泌的细胞。 每10-20秒取样一帧，我们观察每个囊泡的 内容物突然消失，没有颗粒运动的证据。 可以测定单个颗粒的释放速率， 空间耦合有时振荡。 出埃及记时 颗粒通常会留下清晰的足迹，这表明 未溶解的5-羟色胺仍然结合在颗粒基质上。 Denk，W.， D. W.活塞和W. W. Webb（1995年）。 双光子分子激发 在激光扫描显微镜中。 生物共聚焦手册 显微镜 J. B.波利 纽约，Plenum出版社：445-458。 丹克， W.，J. H. Strickler和W. W. Webb（1990年）。 “双光子激光扫描 Maiti，S.，J. B.希尔河M.威廉姆斯，W。R. Zipfel和W. W.韦伯 （1997年）。 “测量血清素在活细胞中的分布， 三光子激发”科学275：530-532。 威廉姆斯河M.，D. W. 活塞和W. W. Webb（1994年）。 “双光子分子激发 为基于激光的显微镜提供固有的三维分辨率 和微光化学。“FASEB J. 8：804-813. Xu，C.和W. W. Webb（1996年）。 “双光子激发截面的测量 分子荧光团的数据从690到1050 nm。“J. Opt. Soc. Am. B 13（3）：481-491。 徐，C.，等（1996）中所述。 “多光子 荧光激发子：生物学的新光谱窗口 非线性显微术“Proc. Natl. Acad. Sci. 93：10763-10768。

Poster given for the Cellular Imaging for Biological Research and Drug Development meeting (Cambridge Healthtech Institute, 12-14 November 1998, SanDiego) Multi-photon (nP) excitation of fluorescence is based on the principle that multiple photons can interact "simultaneously" with a fluorophore and thereby add their energies to excite a transition with multiple times the energy of each individual photon (Denk 1990; Williams 1994; Denk 1995; Xu 1996; Xu 1996). Serotonin absorption bands exist at wavelengths less than 250 nm; thus 2P and 3P absorptions are expected at ~ 500 and ~700 nm respectively. After optical excitation, a serotonin molecule relaxes vibrationally through environmental interactions and releases a fluorescent photon with an energy less than that of the total energy absorbed (~340 nm). In these imaging studies we utilize low energy red photons (740 nm) and a three photon mechanism to activate native serotonin fluorescence. Red light 3P excitation alleviates the need for deep UV optics and their associated aberrations and low transmissivities. Nonlinear excitation is also intrinsically localized to the focal plane and thus is potentially less invasive than single-photon techniques. We have previously shown that 3P microscopy of serotonin-granules in RBL-2H3 cells is possible (Maiti 1997). Here we report 3P imaging measurements of those cells undergoing antigen stimulated secretion. Sampling at one frame every 10-20 seconds, we observe each vesicle's contents to disappear suddenly with no evidence for granule motion. Single granule release rates can be determined and indicate release that is spatially coupled and sometimes oscillatory. Upon exodus granules often leave behind clearly defined footprints, suggesting undissolved serotonin still bound to the granular matrix. Denk, W., D. W. Piston and W. W. Webb (1995). Two-photon molecular excitation in laser-scanning microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. J. B. Pawley. New York, Plenum Press: 445-458. Denk, W., J. H. Strickler and W. W. Webb (1990). "Two-photon laser scanning Maiti, S., J. B. Shear, R. M. Williams, W. R. Zipfel and W. W. Webb (1997). "Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation" Science 275:530-532. Williams, R. M., D. W. Piston and W. W. Webb (1994). "Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry." FASEB J. 8: 804-813. Xu, C. and W. W. Webb (1996). "Measurement of two-photon excitation cross sections of molecular fluorophores with data from 690 to 1050 nm." J. Opt. Soc. Am. B 13(3): 481-491. Xu, C., et al. (1996). "Multiphoton fluorescence excitaiton: new spectral windows for biological nonlinear microscopy." Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10763-10768.