GAG PROFILE OF 2 SAMPLES BY SAX-HPLC

通过 SAX-HPLC 分析 2 个样品的 GAG 谱

基本信息

  • 批准号:
    8361857
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 0.18万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2011
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2011-02-01 至 2012-01-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

This subproject is one of many research subprojects utilizing the resources provided by a Center grant funded by NIH/NCRR. Primary support for the subproject and the subproject's principal investigator may have been provided by other sources, including other NIH sources. The Total Cost listed for the subproject likely represents the estimated amount of Center infrastructure utilized by the subproject, not direct funding provided by the NCRR grant to the subproject or subproject staff. Methods: Chondroitinase digestion A solution (100 ¿L total volume) containing 0.1 mg/mL GAG, 50 mM NH4OAc buffer, pH 6 (kratanase and hyaluronidase) or pH 7 (chondroitinase and heparinase), and 0.1 mU/mL or 20 mU/mL (hyaluronidase only) GAG lyase was incubated at 37 ¿C for 24 h. In the case of hyaluronidase digestion, the samples were incubated for an additional 2 h at 55 ¿C. The enzyme was inactivated by heating to 100 ¿C for 2 min and the samples were centrifuged prior to HPLC analysis. The following enzymes were used: Chondroitinase ABC (F. heparinum, Sigma) Chondroitinase AC (A. aurescens, Sigma) Heparinases I, II, and III (F. heparinum, Grampian) Hyaluronidase (S. hyalurolyticus, Northstar) Keratanase II (Bacillus sp., Northstar) SAX-HPLC SAX-HPLC was carried out on an Agilent system using a 4.6¿250 mm Waters Spherisorb analytical column with 5 ¿m particle size at 25 ¿C. Solvent A: 2.5 mM Na-phosphate, pH 3.5 Solvent B: 2.5 mM Na-phosphate, pH 3.5, 1.2 M NaCl. The flow rate was 1.0 mL/min. Injection volume was 10 ¿L. Detection was performed by post-column derivatization. Briefly, to the eluent from the column was added, from a binary HPLC pump, a 1:1 mixture of 0.25 M NaOH and 1 % 2-cyanoacetamide at 0.5 mL/min. The eluent was then heated to 120 ¿C in a 10-m reaction coil, followed by cooling in a 50-cm cooling coil, and directed into a Shimadzu fluorescence detector. Excitation wavelength was 346 nm and emission wavelength was 410 nm. Commercial standard disaccharides (Dextra Laboratories) were used for calibration for heparinase and chondroitinase digestion mixtures. For the other mixtures enzyme digested authentic keratan sulfate (AMS Biotechnology) and hyaluronic acid (Sigma) samples were used as standards.
这个子项目是许多利用资源的研究子项目之一 由NIH/NCRR资助的中心拨款提供。子项目的主要支持 而子项目的主要调查员可能是由其他来源提供的, 包括其它NIH来源。 列出的子项目总成本可能 代表子项目使用的中心基础设施的估计数量, 而不是由NCRR赠款提供给子项目或子项目工作人员的直接资金。 研究方法: 软骨素酶消化 解决方案(100磅)将含有0.1 mg/mL GAG、50 mM NH 40 Ac缓冲液(pH 6(克拉霉素酶和透明质酸酶)或pH 7(软骨素酶和肝素酶))和0.1 mU/mL或20 mU/mL(仅透明质酸酶)GAG裂解酶的混合物在37 ℃下孵育24 h。在透明质酸酶消化的情况下,将样品在55 ℃下再孵育2小时。通过加热至100 ℃持续2 min使酶失活,并在HPLC分析前离心样品。 使用以下酶: 软骨素酶ABC(F.肝素,Sigma) 软骨素酶AC(A. aurescens,Sigma) 肝素酶I、II和III(F.肝素,格兰扁) 透明质酸酶(S.透明质酸,北极星) 角蛋白酶II(芽孢杆菌属,北极星) sax-HPLC SAX-HPLC在Agilent系统上进行,使用4.6沃茨Spherisorb分析柱,粒径为5 μ m,温度为25 ℃。 溶剂A:2.5 mM磷酸钠,pH 3.5 溶剂B:2.5 mM磷酸钠,pH 3.5,1.2 M NaCl。 流速为1.0 mL/min。 注射体积为10 L。 通过柱后衍生进行检测。简言之,从二元HPLC泵向来自柱的洗脱液中以0.5 mL/min加入0.25 M NaOH和1% 2-氰基乙酰胺的1:1混合物。然后在10-m反应盘管中将洗脱液加热至120 ℃,然后在50-cm冷却盘管中冷却,并导入Shimadzu荧光检测器。激发波长为346 nm,发射波长为410 nm。 商业标准二糖(Dextra Laboratories)用于肝素酶和软骨素酶消化混合物的校准。对于其他混合物,使用酶消化的真实硫酸角质素(AMS Biotechnology)和透明质酸(Sigma)样品作为标准品。

项目成果

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    2024
  • 资助金额:
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  • 资助金额:
    $ 0.18万
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