GM-CSF受容体に対するキメラ抗原受容体発現T細胞の構築と抗白血病効果の検討

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【研究目的】近年、細胞免疫療法としてキメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor,CAR)を発現させた遺伝子改変T細胞療法が報告され、侵襲性の低い次世代治療法とされる。本研究では、NF1、RAS、PTPN11等の遺伝子異常によるGM-CSF受容体-RAS/MAPKシグナルの恒常的活性化を特徴とする若年性慢性骨髄性白血病(JMML)を対象として、GM-SCF受容体に対するCARを用いたpiggy Bacトランスポゾン法による非ウィルス遺伝子改変T細胞の構築と抗腫瘍細胞効果を解析し、JMMLなど血液疾患に対するGM-CSF受容体CAR-T細胞免疫療法の可能性を検討することを目的とした。【研究成果・課題】当初、GM-CSF受容体と結合する分子として、抗GM-CSF受容体モノクローナル抗体の可変部位・超可変部位から成るsingle chain Fv(scFv)を用いることを計画していた。しかし、特異的抗体を産生するハイブリドーマを得ることが出来なかった。そのため、次にGM-CSF受容体と結合する分子として、受容体のリガンドであるGM-CSFを利用することを考案した。具体的な方法と成果について、まず、細胞株U937よりmRNA抽出およびcDNA合成を行った。その後、GM-CSF全長について、PCR法を行い、pTA2ベクターにサブクローニングを行った。その後、全長GM-CSF遺伝子配列の前後に分泌シグナル配列(66塩基)および免疫グロブリン定常領域のヒンジドメインをコードする塩基配列(52塩基)を付加させるため、プライマーに各配列を付加させ、pTA2上のGM-CSFを鋳型として、PCRを行い、サブクローニングを繰り返した。最終的に、(分泌シグナル配列)-(GM-CSF全長)-(ヒンジ配列)のコンストラクトを作製した。今後、CARの細胞質内ドメイン(CD28・T細胞受容体zeta鎖複合体)と本研究で作製したコンストラクトを結合させ、CARトランスポゾンベクターを作製する。また、GM-CSFのGM-CSF受容体α鎖との結合面内、あるいはシグナル活性化に必須の多量体形成に関わるβ鎖との結合面に変異や欠失導入し、GM-CSF受容体活性化を最小限に抑えながら、CARによる抗腫瘍細胞効果を発揮できる系を確立したい。