New Synthetic Methods for Glycoproteins and the Integrated Approaches to Elucidate the Functions of Post-translational Modifications

糖蛋白的新合成方法和阐明翻译后修饰功能的综合方法

基本信息

批准号：
21H05028
负责人：
梶原康宏
金额：
$ 121.39万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-05 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

ヒトのSPINK13という抗がん作用を示す糖タンパク質の合成を試みた。SPINK13はPro-Asn(Glycan)-Val-Thrという非常に嵩高いアミノ酸の間に糖鎖アスパラギンを持っているが、H2N-Asn(Glycan)COSHから5工程でフォールディングした天然型のSPINK13を合成することに成功した。また、抗がん作用を調べたところ、糖鎖がないSPINK13が正常細胞への癌細胞の浸潤を阻害することが明らかとなった。昨年度までに確立したβSHアミノ酸を合成する方法を利用し、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリプトファンの合成、及びキラルカラムによる光学分割に成功した。また、PdによるCH活性化法をもとにγ位にチオールをもつイソロイシン、バリン、トレオニンの合成も確立した。糖鎖をもつ合成EPOおよび、大腸菌で発現し、高度に精製したEPOと、市販のEPOのレセプターとの結合親和力を表面プラズモン共鳴法(SPR)で調べた。その結果、糖鎖化EPOの方が僅かに親和力が高いことが明らかになった。次に糖鎖と水の相互作用を、NMRを用いて調べたところ、NOEが強く観測されたことから、糖鎖構造特異的な水和の生成が示唆された。また、新規なNMR測定法で、糖鎖と水の相互作用を追跡する方法を確立した。糖タンパク質ICOSの膜貫通部分に相当するペプチド配列を、故意に糖鎖付加したスプリットInteinBと連結させたペプチド（InteinB-ICOS）を細胞表層に発現することに成功した。そして、糖鎖化InteinB-ICOSを細胞に発現後、細胞を均一液化した溶液中でProteinA-InteinAを加え、ProteinA-ProteinBが得られることを確認した。現在、合成した糖タンパク質ICOSをinteinAを利用して導入することを検討している。

我们试图合成一种称为Spink13的人糖蛋白，该糖蛋白具有抗癌特性。 Spink13在称为Pro-ASN（Glycan）-VAL-THR的非常大的氨基酸之间携带天冬糖链，但是它已经成功地合成了Spink13的自然形式，以距H2N-ASN（Glycan）Cosh的五个步骤折叠。此外，在检查其抗癌活性时，发现没有糖链的Spink13抑制了癌细胞侵袭正常细胞。使用直到去年建立的βSH氨基酸的合成方法，我们成功合成了精氨酸，赖氨酸，组氨酸和色氨酸，以及使用手性柱的光学分辨率。此外，基于用PD激活CH的方法，建立了在γ位置的异亮氨酸，缬氨酸和苏氨酸的合成。通过表面等离子体共振（SPR）研究了合成EPO与聚糖与高度纯化的EPO之间的结合亲和力。结果，发现糖基化的EPO具有更高的亲和力。接下来，当使用NMR研究糖链和水之间的相互作用时，强烈观察到NOE，这表明形成了特定于糖链结构的水合。此外，已经建立了一种新型的NMR分析，以跟踪糖链与水之间的相互作用。与糖蛋白ICOS的跨膜部分相对应的肽序列成功地在细胞表面A肽（InteinB-ICOS）上表达，其中与糖蛋白ICOS的跨膜序列相对应的肽序列有意与分裂的InteinB有意链接到糖蛋白B中，并有意地添加了与Glycosylation添加的Inteinb。在细胞上表达糖基化的内丁基-ICOS后，在将细胞均匀液化的溶液中添加了蛋白质 - ininteina，并确认可以获得蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白。目前，我们正在考虑使用Inteina引入合成的糖蛋白ICO。