Evaluation of the effect of natural or unnatural glycosylation modes on the activity of glycoproteins

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R３年度では、エリスロポエチンがそのレセプターに結合する際、生じる複合体の界面に存在する糖鎖が複合体の安定性を向上させることを見出した。また、その際、天然型のN型糖鎖結合様式とそのアナログ型糖鎖結合様式では、エリスロポエチンのレセプターへの結合活性に影響がでることをみいだした。そこで、令和４年度は、さらに別のタンパク質複合体をモデルに、複合体界面に存在する糖鎖の影響を調べることとした。モデルとしては、抗体のFc部位に結合する小型タンパク質を選び、その複合体の界面に位置するところに故意にヒトの複合型糖鎖を結合させた小型糖タンパク質を新規に合成することに成功した。そして抗体との結合親和力を調べた結果、小型タンパク質の抗体への結合親和力が僅かではあるが向上することが確認できた。そこで、ヒトのN型糖鎖の還元末端とタンパク質間の距離を可変した非天然型糖タンパク質の合成をおこなった。まず鶏卵から単離したN型糖鎖のアスパラギンを除去し、還元末端が遊離となった糖鎖を合成した。そしてアミノ基を導入後、グリシン、βアラニンをそれぞれ連結後、アミノ酸のアミノ基にクロロ酢酸を縮合し、非天然型結合様式の糖鎖を合成することに成功した。現在、これら糖鎖基質をシステインを導入した小型タンパク質にハロアセトアミド法で結合させ非天然型結合様式の糖タンパク質を合成している。またアクアポリンの糖鎖と水の相互作用を調べる実験を検討しているが膜タンパク質であるアクアポリンの合成法に改良をする必要があった。幸い、糖鎖をペプチド中に脱着可能な方法で結合させることで、超難溶性のペプチドを可溶化する方法を見出すことに成功した。これは、世界的に問題とされている超難溶性のタンパク質の合成に大きな貢献をすることが期待できるものである。現在、この手法を種々な超難溶性のペプチドに連結し可溶化できるか検討をしている。