Evaluation of the effect of natural or unnatural glycosylation modes on the activity of glycoproteins

评估天然或非天然糖基化模式对糖蛋白活性的影响

• 批准号: 21K18215
• 负责人: 梶原 康宏
• 金额: $ 16.64万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K18215/
• 关键词: 糖鎖; 糖タンパク質; 水和; エリスロポエチン; 水和殻; 膜糖タンパク質; 揺らぎ

R３年度では、エリスロポエチンがそのレセプターに結合する際、生じる複合体の界面に存在する糖鎖が複合体の安定性を向上させることを見出した。また、その際、天然型のN型糖鎖結合様式とそのアナログ型糖鎖結合様式では、エリスロポエチンのレセプターへの結合活性に影響がでることをみいだした。そこで、令和４年度は、さらに別のタンパク質複合体をモデルに、複合体界面に存在する糖鎖の影響を調べることとした。モデルとしては、抗体のFc部位に結合する小型タンパク質を選び、その複合体の界面に位置するところに故意にヒトの複合型糖鎖を結合させた小型糖タンパク質を新規に合成することに成功した。そして抗体との結合親和力を調べた結果、小型タンパク質の抗体への結合親和力が僅かではあるが向上することが確認できた。そこで、ヒトのN型糖鎖の還元末端とタンパク質間の距離を可変した非天然型糖タンパク質の合成をおこなった。まず鶏卵から単離したN型糖鎖のアスパラギンを除去し、還元末端が遊離となった糖鎖を合成した。そしてアミノ基を導入後、グリシン、βアラニンをそれぞれ連結後、アミノ酸のアミノ基にクロロ酢酸を縮合し、非天然型結合様式の糖鎖を合成することに成功した。現在、これら糖鎖基質をシステインを導入した小型タンパク質にハロアセトアミド法で結合させ非天然型結合様式の糖タンパク質を合成している。またアクアポリンの糖鎖と水の相互作用を調べる実験を検討しているが膜タンパク質であるアクアポリンの合成法に改良をする必要があった。幸い、糖鎖をペプチド中に脱着可能な方法で結合させることで、超難溶性のペプチドを可溶化する方法を見出すことに成功した。これは、世界的に問題とされている超難溶性のタンパク質の合成に大きな貢献をすることが期待できるものである。現在、この手法を種々な超難溶性のペプチドに連結し可溶化できるか検討をしている。

R3 annual で は, エ リ ス ロ ポ エ チ ン が そ の レ セ プ タ ー に combining す る interstate, raw じ る complex の interface に exist す る sugar が complex の stability を lock up さ せ る こ と を shows し た. ま た, そ の interstate, natural の N combined with others in sugar lock type と そ の ア ナ ロ グ combined with others in sugar lock type で は, エ リ ス ロ ポ エ チ ン の レ セ プ タ ー へ に の combining activity が で る こ と を み い だ し た. そ こ で, and 4 annual は, さ ら に don't の タ ン パ ク qualitative complex を モ デ ル に exist, complex interface に す る sugar lock の influence を adjustable べ る こ と と し た. モ デ ル と し て は, antibody の に Fc parts combine す る small タ ン パ ク を choose び, そ の complex の interface position に す る と こ ろ に deliberately に ヒ ト の complex sugar を combination lock さ せ た small sugar タ ン パ ク qualitative を new rules に synthetic す る こ と に successful し た. そ し て antibody と の combined with affinity を adjustable べ た results, small タ ン パ ク qualitative の antibody へ の affinity が か only で は あ る が upward す る こ と が confirm で き た. そ こ で, ヒ ト の N sugar lock の is yuan end と タ ン パ ク の distance between qualitative を can - し た non natural sugar タ ン パ ク qualitative の synthetic を お こ な っ た. ま ず 鶏 eggs か ら 単 from し た N sugar lock の ア ス パ ラ ギ ン を remove し, yuan also end が free と な っ た sugar lock を synthetic し た. そ し て ア ミ ノ base を after import, グ リ シ ン, beta ア ラ ニ ン を そ れ ぞ れ link, after ア ミ ノ acid の ア ミ ノ base に ク ロ ロ を boggy acid condensation し, non natural combined with others in の sugar を lock synthetic す る こ と に successful し た. Now, こ れ ら sugar lock matrix を シ ス テ イ ン を import し た small タ ン パ ク qualitative に ハ ロ ア セ ト ア ミ ド method combining で さ せ unnatural combined with others in type の sugar タ ン パ ク qualitative を synthetic し て い る. ま た ア ク ア ポ リ ン の sugar water lock と の interaction を adjustable べ る be 験 を beg し 検 て い る が membrane タ ン パ ク qualitative で あ る ア ク ア ポ リ ン の synthesis に improved を す る necessary が あ っ た. Luckily い, sugar lock を ペ プ チ ド に in off the possible な method で さ せ る こ と で, super difficult soluble の ペ プ チ ド を solubilization す る を see from す こ と に successful し た. こ れ は, world に problem と さ れ て い る super difficult soluble の タ ン パ ク の quality synthetic に big き な contribution を す る こ と が expect で き る も の で あ る. Now, こ の gimmick を kind 々 な super difficult soluble の ペ プ チ ド に link し solubilization で き る か beg を 検 し て い る.

项目成果

Synthesis of fluorogenic glycan probes for detecting ENGases activity

用于检测 ENGase 活性的荧光聚糖探针的合成

• 发表时间: 2022
• 作者: Nozomi Ishii;Ichiro Matsuo
• 通讯作者: Ichiro Matsuo

蛍光標識二本鎖複合型糖鎖プローブを用いたENGaseの活性検出

使用荧光标记的双链复合聚糖探针检测 ENGase 活性

• 发表时间: 2021
• 作者: 石井希実;永田光穂;髙垣智迪;佐野加苗;佐藤 樹;高橋 諭;江橋竜史;松尾一郎
• 通讯作者: 松尾一郎

新規One-Pot法よる糖タンパクの化学合成と糖鎖の特異的水和効果

新型一锅法化学合成糖蛋白及糖链的特异性水合效应

• 发表时间: 2022
• 作者: 芝田 大之;田中 裕也;趙 冬林;真木 勇太;梶原 康宏;岡本 亮
• 通讯作者: 岡本 亮

Chemical synthesis of an erythropoietin glycoform having a semisynthesized triantennary oligosaccharide and its biological evaluation

半合成三触角寡糖促红细胞生成素糖型的化学合成及其生物学评价

• 发表时间: 2021
• 作者: Y. Maki;R. Okamoto;M. Izumi;Y. Kajihara
• 通讯作者: Y. Kajihara

Optimization of Semisynthetic Approach for Glycosyl Interferon beta polypeptide by Utilizing Bacterial Protein Expression and Chemical Modification

利用细菌蛋白表达和化学修饰优化糖基干扰素β多肽的半合成方法

• DOI: 10.1039/d1ob02391h
• 发表时间: 2022
• 期刊: Organic & Biology Chemistry
• 作者: Yie-Kie Chong;Chaitra Chandrashekar;Donglin Zhao;Yuta Maki;Ryo Okamoto;Yasuhiro Kajihara
• 通讯作者: Yasuhiro Kajihara