抑制性シナプス後部の分子構成解明と特定の抑制性シナプス操作技術の開発

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脳には様々な種類の抑制性神経細胞が存在するが、それぞれのシナプスに集積する分子の構成は明らかになっていない。本研究では、様々な分類が存在する抑制性シナプスのシナプス後部において、「どの抑制性シナプスにどの分子が局在しているのか？」という学術的問いを明らかにし、さらにそれらの分子を人為的に操作することによって、特定の抑制性シナプスを得意的に操作する技術を開発することを目的としている。三年間の研究期間の二年目である本年度は、初年度で検討したAAVを用いた遺伝子導入方を活用し、脳内への目的遺伝子の発現系確立に焦点を当てて研究を遂行した。本研究では、大脳皮質錐体細胞における抑制性シナプス後部分子を精製・同定するため、近接依存性ビオチン化標識酵素TurboIDにALFAタグ・膜貫通ドメインを導入したタンパク質(labeling module)を錐体細胞へ、さらにこのタンパク質を特定の抑制性シナプスへ局在させるためのGPIアンカーを融合した抗ALFAナノボディ（targeting module）を抑制性神経細胞へ、発現させる。初めに、抑制性シナプス全般をラベルできるか検討するために、SynプロモーターとmiRNAの標的配列を組み合わせた抑制性神経細胞特異的AAVベクターにlabeling moduleを組み込んだ。また、labeling moduleはCaMKIIプロモーターの下流に組み込んだ。これらのAAVを血液脳関門透過型のCapsidで作成し、大脳皮質に直接AAVを打ち込みWestern blottingと免疫染色をしたところ、Targeting module、Labeling moduleのどちらも、発現していることが確認された。