細菌感染に対する新規自然免疫シグナル伝達の構造生物学的研究

本研究は、細菌に応答して転写因子NF-kBを活性化する新規自然免疫シグナル伝達機構を原子レベルで理解し、細菌感染防御機構の基礎的知見を得ることを目的としている。本シグナル伝達経路では、細菌の代謝産物が細胞内のキナーゼを活性化し、基質タンパク質がリン酸化を受けることで、ユビキチンリガーゼ複合体が形成され、NF-kBが活性化される。現在、これらタンパク質によって形成されるユビキチンリガーゼ複合体の構造解析を進めている。昨年度よりリン酸化ミミック基質タンパク質複合体の結晶化とX線回折実験を進めており、得られた結晶がタンパク質由来であることを結晶UV蛍光観察システムとX線回折像より確認していたが、構造解析に適した分解能での構造解析には至っていなかった。そこで、本結晶化条件についてタンパク質濃度、添加剤、温度等の検討を行い、結晶の大きさと質を改善することで、放射光施設Photon Factoryのビームラインで3.8 オングストローム分解能のX線回折強度データを収集することができた。構造解析の結果、リン酸化ミミック基質タンパク質以外の複合体構成タンパク質の電子密度は観察されず、リン酸化ミミック基質タンパク質単独の結晶構造であった。本複合体については、別の条件でも6 オングストローム程度の分解能の結晶が得られているため、これら結晶化条件を最適化して、複合体のX線結晶構造解析を進める。またリン酸化基質タンパク質については、非常に凝集しやすい多量体を形成することがわかっていたため、界面活性剤の種類と濃度の検討を行った。本結果と動的光散乱で測定する分子の粒子径の結果を合わせて、良好な条件を選定し、結晶化スクリーニングを実施する。

本研究は、細菌に応答して転写因子NF-kBを活性化する新規自然免疫シグナル伝達機構を原子レベルで理解し、細菌感染防御機構の基礎的知見を得ることを目的としている。本シグナル伝達経路では、細菌の代謝産物が細胞内のキナーゼを活性化し、基質タンパク質がリン酸化を受けることで、ユビキチンリガーゼ複合体が形成され、NF-kBが活性化される。現在、これらタンパク質によって形成されるユビキチンリガーゼ複合体の構造解析を進めている。昨年度よりリン酸化ミミック基質タンパク質複合体の結晶化とX線回折実験を進めており、得られた結晶がタンパク質由来であることを結晶UV蛍光観察システムとX線回折像より確認していたが、構造解析に適した分解能での構造解析には至っていなかった。そこで、本結晶化条件についてタンパク質濃度、添加剤、温度等の検討を行い、結晶の大きさと質を改善することで、放射光施設Photon Factoryのビームラインで3.8 オングストローム分解能のX線回折強度データを収集することができた。構造解析の結果、リン酸化ミミック基質タンパク質以外の複合体構成タンパク質の電子密度は観察されず、リン酸化ミミック基質タンパク質単独の結晶構造であった。本複合体については、別の条件でも6 オングストローム程度の分解能の結晶が得られているため、これら結晶化条件を最適化して、複合体のX線結晶構造解析を進める。またリン酸化基質タンパク質については、非常に凝集しやすい多量体を形成することがわかっていたため、界面活性剤の種類と濃度の検討を行った。本結果と動的光散乱で測定する分子の粒子径の結果を合わせて、良好な条件を選定し、結晶化スクリーニングを実施する。