ヒトホスホリパーゼDのドメイン解剖学による細胞シグナル伝達機構の研究

人磷脂酶D结构域解剖研究细胞信号转导机制

• 批准号: 14780526
• 负责人: 廣明 秀一
• 金额: $ 2.62万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780526/
• 关键词: ホスホリパーゼD; ホスファチジン酸; エンドソーム; PX domain; ドメイン解剖学; SH3 domain; MIT domain; PRESAT-vector; 脂質結合ドメイン; PXドメイン; PHドメイン; 人工シャペロン; タンパク質の巻き戻し

本研究は、ヒトホスホリパーゼD(PLD)と代謝産物ホスファチジン酸(PA)のシグナル伝達機構を、構造生物学的に解明することが最終的な目的である。本課題では、(1)PLDの細胞内局在や活性を制御しているN末端領域から、単独でfoldingするドメインを単離し構造解析を行うドメイン解剖学的研究、(2)PLDシグナル経路下流に存在するエフェクターを同定する目的で新規PA結合ドメインの探索、(3)両者に共通するドメイン解剖学の基盤技術の開発を行った。その結果(1)PLDのN末端に存在するPLD1-PXの発現系・巻き戻し条件を確立しNMR測定に成功した。PLD1-PXは溶解度が低く、部分的に非特異的に会合し、6割強のNMRシグナルしか観測できなかった。生化学的実験には十分な試料を得る方法が確立できた。今後、脂質結合特異性を決定する。(2)2003年にJangらによりPLD2-PXとPLCγ1-SH3の相互作用のシグナル伝達における重要性が示された。類似のドメイン間相互作用系として、PLD2-PXよりも溶解度の高いp47PXとp47SH3Cを用いて、脂質結合の変化を調べた。PI(45)P_2との結合はSH3により阻害される一方、PAとの結合は阻害されなかった(論文1)(3)新規膜結合ドメインを探索するために、それに適した発現系構築法(PRESAT-vector法)を開発し、MITドメインとPXAドメイン計9種類の発現実験を行った(論文2)。いずれもエンドソーム因子SNX中でPXに隣接して現れるドメインであり、PLD下流因子である可能性がある。現在、MITの一つにPIP結合活性があることを見出し、立体構造解析中である。(4)ドメイン解剖学的手法の基盤として、溶解度の低い蛋白質ドメインのNMR解析法を開発した。GCMをモデル試料として実証実験を行い、その完全帰属に成功した(論文3)。

This study aims to clarify the mechanism of molecular biology and the ultimate purpose of structural biology by studying the mechanism of molecular biology and the metabolites of PLD and PA. The purpose of this project is to (1) study the anatomy of PLD in the N-terminal domain of the intracellular regulation of PLD activity, to analyze the structure of PLD alone,(2) explore the new PA binding model for the purpose of identifying the downstream existence of PLD in the pathway, and (3) develop the basic technology of PLD in common anatomy. Results (1) The N-terminal presence of PLD was successfully determined by NMR. PLD1-PX has low solubility, partial non-specific binding, and 6-band NMR spectra. The method of biochemical experiment was established. In the future, lipid binding specificity will be determined. (2) In 2003, the importance of the interaction between PLD2-PX and PLCγ1-SH3 was demonstrated. The interaction between the two molecules is similar to that between PLD2-PX and p47SH3C. The solubility of PLD2-PX and p47SH3C is higher than that of PLD2-PX. PI(45)P_2 and PA (45)P_2 are bound to SH_3 and P_3 respectively.(1)(3) The development of new membrane binding systems (PRESAT-vector method) and the development of MIT and PXA systems (2). PX is the next best factor in SNX, PLD is the next best factor. At present, MIT's PIP combination activity is seen, and the three-dimensional structure analysis is in progress. (4)A new method of NMR analysis for the determination of soluble proteins in human body was developed. GCM is a complete success in the implementation of test materials (Paper 3).

项目成果

Goda, N., Tenno, T., Takasu, H., Hiroaki, H*., Shirakawa, M.: "The PRESAT-vector : Asymmetric T-vector for high-throughput screening of soluble protein domains."Protein Science. 13. 652-658 (2004)

Goda, N.、Tenno, T.、Takasu, H.、Hiroaki, H*.、Shirakawa, M.：“PRESAT 载体：用于高通量筛选可溶性蛋白结构域的不对称 T 载体。”蛋白质科学。