Study of molecular mechanisms of retinal development by single cell RNA-seq analysis

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申請者は、本研究において、網膜の細胞運命決定と成熟ならびに選択的シナプス形成に関わる因子を、発生期マウス網膜を用いたシングルセルRNA-seq解析によって、発生過程の遺伝子発現プロファイルを一細胞レベルの解像度で可視化することによって同定し、それらの機能とその作用メカニズムを生体レベルで明らかにし、中枢神経系の発生の分子メカニズムや網膜視覚回路の機能発現の理解に貢献することを目指している。申請者は、初年度にシングルセルRNA-seq解析によって同定した複数の候補遺伝子の中から、昨年度に、網膜未分化前駆細胞から視細胞前駆細胞へと分化するに従って特異的に発現が増加する機能未知な蛋白質をコードする遺伝子を新たに同定した。網膜のシングルセルRNA-seq解析から、アマクリン細胞に分化する過程に特異的に発現する遺伝子として別の機能未知の転写因子も同定した。ウイルスベクターを用いた当該蛋白質および転写因子の遺伝子発現による細胞系譜解析を行い、網膜未分化前駆細胞におけるこれら分子の発現により、それぞれ視細胞あるいはアマクリン細胞の分化が促進されることを見出した。さらに、これらの遺伝子のウイルスベクターを用いたノックダウン実験により、視細胞あるいはアマクリン細胞の分化が阻害されることも見出した。これら当該遺伝子のKOマウスを作製し、組織学的解析や網膜電図解析などを行うとともに、アマクリン分化転写因子のKOマウスの発生期の網膜を用いたシングルセルRNA-seq解析を行い、細胞運命に関わると考えられる遺伝子プロファイルのデータを得た。