Regulatory mechanism of neuronal migration in 3D brain tissue

(1) アクトミオシン収縮による牽引と押圧の切替え機構: ミクロ加工技術で作成したパターン化基質を用い、４方を囲まれた立体空間を遊走する小脳顆粒細胞のアクチン流動を観察したところ、先導突起から核後方への逆行流が観察された。並行して、立体空間の遊走に必要なシグナル経路を分子操作と薬理阻害実験で検証した結果、機械刺激受容体、細胞内カルシウム、MLCKの関与が明らかになった。単離顆粒細胞を用いて分子操作を行なった結果、隘路遊走で起こる細胞膜への張力負荷が機械刺激受容体を活性化し、カルシウム流入を誘発してミオシンが活性化する一連の分子経路が明らかになった。(2) 両方向性微小管モーターの連携による一方向性核輸送の動態と制御機構：顆粒細胞に強く発現する核膜アダプターNesprin2と、キネシンおよびダイニンとの結合活性を生化学実験で解析した。キネシンおよびダイニン制御分子ダイナクチンがNesprinの細胞質近位領域に相互非依存的に結合することが明らかになった。また相互作用分子ペア(FKBP-FRB)を用いた積荷輸送動態解析により、両方向性モーター分子によるNesprin発現小胞の動態を解析したところ、小胞は微小管両端へ移動すること、両方向性モーターがないとどちらにも移動できないことがわかり、ダイニン、キネシンが相互に活性を補助し合う（協調）ことが示唆された。(3) 隘路遊走する核の損傷修復機構：小脳顆粒細胞が隘路を通過後一過的にDNA二重鎖切断(DSB)の修復機構を同定するため、培養再構成系にて相同組換え(HR)と非相同末端結合(NHEJ)の何れの経路が関与するかを各経路の特異的阻害剤を用いて検証した。その結果HRは関与せず、LIG4の活性が不可欠でNHEJにより修復されることが示唆された。

(1) アクトミオシン収縮による牽引と押圧の切替え機構: ミクロ加工技術で作成したパターン化基質を用い、４方を囲まれた立体空間を遊走する小脳顆粒細胞のアクチン流動を観察したところ、先導突起から核後方への逆行流が観察された。並行して、立体空間の遊走に必要なシグナル経路を分子操作と薬理阻害実験で検証した結果、機械刺激受容体、細胞内カルシウム、MLCKの関与が明らかになった。単離顆粒細胞を用いて分子操作を行なった結果、隘路遊走で起こる細胞膜への張力負荷が機械刺激受容体を活性化し、カルシウム流入を誘発してミオシンが活性化する一連の分子経路が明らかになった。(2) 両方向性微小管モーターの連携による一方向性核輸送の動態と制御機構：顆粒細胞に強く発現する核膜アダプターNesprin2と、キネシンおよびダイニンとの結合活性を生化学実験で解析した。キネシンおよびダイニン制御分子ダイナクチンがNesprinの細胞質近位領域に相互非依存的に結合することが明らかになった。また相互作用分子ペア(FKBP-FRB)を用いた積荷輸送動態解析により、両方向性モーター分子によるNesprin発現小胞の動態を解析したところ、小胞は微小管両端へ移動すること、両方向性モーターがないとどちらにも移動できないことがわかり、ダイニン、キネシンが相互に活性を補助し合う（協調）ことが示唆された。(3) 隘路遊走する核の損傷修復機構：小脳顆粒細胞が隘路を通過後一過的にDNA二重鎖切断(DSB)の修復機構を同定するため、培養再構成系にて相同組換え(HR)と非相同末端結合(NHEJ)の何れの経路が関与するかを各経路の特異的阻害剤を用いて検証した。その結果HRは関与せず、LIG4の活性が不可欠でNHEJにより修復されることが示唆された。