DNA結合能を有する微小管モーター蛋白質(Kid)の細胞分裂及び増殖における機能

具有DNA结合能力的微管运动蛋白（Kid）在细胞分裂和增殖中的功能

• 批准号: 07458188
• 负责人: 山本 雅
• 金额: $ 4.74万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 1997
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07458188/
• 关键词: 細胞分裂; 紡錘体形成; 染色体分配; 細胞周期依存的リン酸化; セントロメア; モーター蛋白質; キネシン; Kid; α-サテライトDNA; ユビキチネーション; 核膜崩壊; アルフォイドDNA; EBウイルス

KidはDNA結合能を持つキネシン様モーター蛋白質で細胞分裂期(細胞周期M期)で重要な役割を果たしていることが示唆されている。今年度は、昨年度までに見出したKid会合蛋白質の解析と、Kidのリン酸化による機能制御に関する解析を主として行った。1. yeast two-hybrid法により、Kid会合蛋白質の候補として見出したFAFl,UBC9各蛋白質の全長cDNAを得た。このうちFAF1とUBC9cDNAについてはFLAGTagをつけて発現ベクターpMEI8Sに組み込んだ。これをKidと共に293T細胞に共発現させ、その細胞抽出液を用いた免疫共沈実験を行った。その結果、293T細胞内でもKidはFAF1やUBC9と会合しうることが分かった。2. HeLa細胞をS期で同調させ、細胞周期依存的Kid蛋白質のリン酸化を調べた。その結果、M期でKid蛋白質がよりリン酸化されていることが示唆された。Kid蛋白質はcdc2キナーゼによりリン酸化されうる配列TPKRERを有しており、事実カエル卵から精製したcyclinB/cdc2キナーゼによってin vitroでリン酸化された。又、M期の進行に重要であることが報告されているPLKキナーゼについても、そのcDNAにmyc Tagをつけた発現プラズミドを導入した細胞の抽出液を用い、その中の抗myc抗体による沈降物がGST Kidをin vitroでリン酸化することを示した。次いでcdc2キナーゼによりリン酸化を受けると予測された配列(TPKRER)の、リン酸化型を特異的に認識する抗体を作成した。3. 米国UCSFのグループとの共同研究により、カエル卵抽出液中に抗Kid抗体と反応する約61kDa蛋白質の存在が確認された。おそらくこれは、カエルKid蛋白質と考えられ、cDNAクローニングを試みている。

Kid は DNA binding energy を hold つ キ ネ シ ン others モ ー タ ー protein で cell division period (cell cycle phase M) で important な "を cut fruit た し て い る こ と が in stopping さ れ て い る. Map out our annual ま は, yesterday で に し た meet Kid protein analytical と の, Kid の リ ン acidification に よ る function suppression に masato す る parsing を main と し て line っ た. 1. The yeast two-hybrid method によ, Kid syncopation protein <s:1> candidate と て て yielded <s:1> FAFl, and the full-length cDNA of each protein fragment of UBC9 を obtained た. こ の う ち FAF1 と UBC9cDNA に つ い て は FLAGTag を つ け て 発 now ベ ク タ ー pMEI8S に group み 込 ん だ. こ れ を Kid に と に 293 t cells were 発 now さ せ, そ の cell extract を with い た immune were shen be 験 を line っ た. The そ そ results showed that in 293T cells, で で Kid で FAF1やUBC9と met up with <s:1> うる とが とが and とが で った. 2. The をS phase of HeLa cells is で in harmony with させ, and the cell cycle-dependent Kid protein is <s:1> リ and <s:1> acidified を in べた. The そ そ result, the m-phase でKid protein がよ がよ リ <e:1> acidification されて る る とが とが indicates された. Kid protein は cdc2 キ ナ ー ゼ に よ り リ ン acidification さ れ う る match column TPKRER を have し て お り, things be カ エ ル eggs か ら refined し た cyclinB/cdc2 キ ナ ー ゼ に よ っ て in vitro で リ ン acidification さ れ た. Stage again, M の were important で に あ る こ と が report さ れ て い る PLK キ ナ ー ゼ に つ い て も, そ の cDNA に myc Tag を つ け た 発 now プ ラ ズ ミ ド を import し た cells の extract を い, そ の の myc antibody resistance in に よ る sink content が GST Kid を in vitroでリ とを acidification する とを とを shows た. Time い で cdc2 キ ナ ー ゼ に よ り リ ン acidification を by け る と be さ れ た match column (TPKRER) の, リ ン acidification model を specific に know す る antibody を made し た. 3 m the UCSF の グ ル ー プ と の joint research に よ り, カ エ ル eggs in the extract に Kid antibody と resistance against 応 す る about 61 kda protein の exist が confirm さ れ た. お そ ら く こ れ は, カ エ ル Kid protein と exam え ら れ, cDNA ク ロ ー ニ ン グ を try み て い る.

项目成果

Yamanoto,T.: "Superfamilies of Protooncogenes:Homology Cloning and Characterization of Related Members." Methods in Enzymology(eds.Vogt and Verma)Academic Press., 15 (1995)

Yamanoto,T.：“原癌基因超家族：相关成员的同源克隆和表征。”

Dusko Ilic: "Focal adhesion kinase at the crossroads of signal transduction." J.Cell.Sci.(in press).

Dusko Ilic：“信号转导十字路口的粘着斑激酶。”

Yamamoto,T.: "Molecular biology of cancer:Oncogenes and tumorsuppressor genes." Molecular Biology in Clinical Oncology and Hematology, 15 (1995)

Yamamoto,T.：“癌症的分子生物学：癌基因和肿瘤抑制基因。”

Yasunaga,M.: "Involvement of Fyn Tyrosine Kinase in Progression of Cytokinesis of B Lymphocyle Progenitor." J.Cell Biol.(in press). (1996)

Yasunaga,M.：“Fyn 酪氨酸激酶参与 B 淋巴细胞祖细胞细胞分裂过程”。

Dusko Ilic: "Imairment of mobiliy in endodermal cells by FAK deficiency." Exp.Cell Res.222. 298-303 (1996)

Dusko Ilic：“FAK 缺陷导致内胚层细胞活动能力受损。”