iPS細胞由来ニューロンの単一細胞解析を可能とするデバイス構築

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半導体加工技術を利用して、SiN製多孔膜（一辺約300μm、厚さ約1μm、孔径約3μm）を底面に有するSi製マイクロウェルを16個×16個のマトリックス状にアレイ化し、これを培養用デバイスとした。また、単一ニューロン播種用デバイスとして、同様のマイクロウェル・アレイを形成し、その底面のSiN膜（一辺約150μm、厚さ約1μm）に単一の微小孔（直径約13μm）を形成した。培養用デバイスに凸部を、播種用デバイスに凹部を形成し、凸部と凹部をはめ込むようにして培養用デバイスの上に播種用デバイスを重ねることで、面内の位置合わせを実現するとともに、両デバイスのSiN膜間のギャップを約150μmになるように設定した。播種用デバイスの上部よりニューロンの細胞懸濁液を導入し、その各ウェル底面の単一微小孔を通じて、単一ニューロンを培養用デバイスの各ウェル底面上に落下させた。これにより、培養用デバイスの20%以上のウェル内に単一ニューロンを導入することが可能になり、単一ニューロン播種の成功率を従来の数%から大幅に向上させた。さらに、Si基板で保持したSiN製自立膜（一辺約2.5mm、厚さ約1μm）を形成し、膜表面に白金黒製の微小電極（一辺約50μm）を4×4個のアレイ状に配置し、膜内に金製の配線を形成した。そして、電極と配線を避けるように、多数の微小孔（直径約6μm）を形成した。マウス大脳皮質アストロサイトを膜裏面に培養した後に、ヒトiPS細胞からグルタミン酸作動性ニューロンへの分化途中の細胞を膜表面（電極形成面）に播種し、共培養を開始した。分化誘導開始後約3週間でニューロンのスパイク状の細胞外電位が観測され、その後、培養日数の経過とともにスパイクの数と振幅が増大しニューロンが成熟する様子を確認した。