iPS細胞由来ニューロンの単一細胞解析を可能とするデバイス構築

构建能够对 iPS 细胞衍生神经元进行单细胞分析的装置

• 批准号: 20H04506
• 负责人: 安田 隆
• 金额: $ 11.32万
• 依托单位: Kyushu Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H04506/
• 关键词: 単一細胞解析; ニューロン; iPS細胞; 細胞外電位計測; マイクロデバイス; 微小孔; 微小電極; アストロサイト; 共培養

半導体加工技術を利用して、SiN製多孔膜（一辺約300μm、厚さ約1μm、孔径約3μm）を底面に有するSi製マイクロウェルを16個×16個のマトリックス状にアレイ化し、これを培養用デバイスとした。また、単一ニューロン播種用デバイスとして、同様のマイクロウェル・アレイを形成し、その底面のSiN膜（一辺約150μm、厚さ約1μm）に単一の微小孔（直径約13μm）を形成した。培養用デバイスに凸部を、播種用デバイスに凹部を形成し、凸部と凹部をはめ込むようにして培養用デバイスの上に播種用デバイスを重ねることで、面内の位置合わせを実現するとともに、両デバイスのSiN膜間のギャップを約150μmになるように設定した。播種用デバイスの上部よりニューロンの細胞懸濁液を導入し、その各ウェル底面の単一微小孔を通じて、単一ニューロンを培養用デバイスの各ウェル底面上に落下させた。これにより、培養用デバイスの20%以上のウェル内に単一ニューロンを導入することが可能になり、単一ニューロン播種の成功率を従来の数%から大幅に向上させた。さらに、Si基板で保持したSiN製自立膜（一辺約2.5mm、厚さ約1μm）を形成し、膜表面に白金黒製の微小電極（一辺約50μm）を4×4個のアレイ状に配置し、膜内に金製の配線を形成した。そして、電極と配線を避けるように、多数の微小孔（直径約6μm）を形成した。マウス大脳皮質アストロサイトを膜裏面に培養した後に、ヒトiPS細胞からグルタミン酸作動性ニューロンへの分化途中の細胞を膜表面（電極形成面）に播種し、共培養を開始した。分化誘導開始後約3週間でニューロンのスパイク状の細胞外電位が観測され、その後、培養日数の経過とともにスパイクの数と振幅が増大しニューロンが成熟する様子を確認した。

The semiconductor processing technology uses SiN porous film (about 300μm, thickness about 1μm, pore diameter about 3μm). There are 16 x 16 SiN porous films on the bottom surface. The SiN film (approximately 150μm in length and 1μm in thickness) on the bottom surface of the seed is formed, and a single microhole (approximately 13μm in diameter) is formed. The convex part for culture and the concave part for seeding are formed, the convex part and the concave part are formed, and the position of the in-plane combination is set at about 150μm. The cell suspension of the upper part of the seed is introduced into the cell suspension, and the cell suspension of the lower part of each cell is introduced into the cell suspension. More than 20% of the seeds used for cultivation were introduced into the plant, and the success rate of seeding increased significantly. In addition, the Si substrate is maintained to form a SiN free-standing film (about 2.5 mm in thickness and about 1μm in thickness), platinum black microelectrodes (about 50μm in thickness) are arranged in 4×4 shapes on the film surface, and gold wiring is formed in the film. Most of the micro-holes (about 6μm in diameter) are formed in the electrode wiring. The cells in the process of differentiation of iPS cells are seeded on the membrane surface (electrode formation surface) after they are cultured in the membrane. About 3 weeks after the initiation of differentiation induction, the number and amplitude of extracellular potentials in the culture medium increased, and the mature cells were confirmed.

项目成果

微小電極アレイを形成した多孔膜へのニューロン・アストロサイト共培養系の構築

微电极阵列多孔膜上神经元-星形胶质细胞共培养系统的构建

• 发表时间: 2021
• 作者: 吉田悟志;安田隆
• 通讯作者: 安田隆

微小電極アレイデバイスを用いたアストロサイトの細胞外電位計測

使用微电极阵列装置测量星形胶质细胞的细胞外电位

• 发表时间: 2021
• 作者: 吉田悟志;安田隆
• 通讯作者: 安田隆

階層型マイクロウェルデバイスを用いた単一ニューロンアレイの形成

使用分层微孔装置形成单神经元阵列

• 发表时间: 2022
• 作者: 仲摩綾香;安田隆
• 通讯作者: 安田隆

SiN多孔膜を介する単一ニューロン・アストロサイト共培養を目指したデバイス構築

通过 SiN 多孔膜构建单神经元/星形胶质细胞共培养的装置

• 发表时间: 2020
• 作者: 仲摩綾香;安田隆
• 通讯作者: 安田隆

ニューロン・アストロサイト共培養系におけるアストロサイトの電気的信号計測

神经元-星形胶质细胞共培养系统中星形胶质细胞电信号的测量

• 发表时间: 2022
• 作者: 吉田悟志;安田隆
• 通讯作者: 安田隆