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Analysis of stemness, aging and carcinogenesis using hematopoietic stem cell ex vivo amplification system

利用造血干细胞离体扩增系统分析干性、衰老和致癌作用

基本信息

批准号：
20H05695
负责人：
中内啓光
金额：
$ 126.96万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University (2022-2023)The University of Tokyo (2020-2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-08-31 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

マウス造血幹細胞長期培養後において造血幹細胞機能と相関する細胞表面マーカーを評価しこれを同定した。また、培養条件の最適化によって造血幹細胞分画のさらなる増殖が得られた。新たに同定した培養後造血幹細胞分画を用いてRNAシークエンスを用いた網羅的遺伝子発現解析を開始しており、現在解析を進めている。マウス造血幹細胞の長期培養により遺伝子変異が集積するかを評価するため、造血幹細胞を2ヶ月間培養し、遺伝子変異の集積をwhole exon sequencingを用いて経時的に評価したところ、長期の造血幹細胞の培養が遺伝子変異の蓄積と相関することが明らかとなった。造血幹細胞の網羅的遺伝子ノックアウトスクリーニングとしてCas9タンパク質を発現する遺伝子改変マウスから造血幹細胞を採取し長期培養によって増殖しノックアウトスクリーニングを行った。同時にCRISPR gRNAライブラリー導入後に造血幹細胞移植を行い、レシピエントマウス体内で再構築されたドナー血液細胞中のgRNAの頻度の解析から、生体内での再構築能に影響を与える遺伝子ノックアウトの探索を行っている。得られた候補遺伝子のノックアウトによって表現型が得られるかの確認を進めている。これまで得られたマウス造血幹細胞を用いた培養方法最適化の知見をヒト造血幹細胞に応用したところ、ヒト臍帯血CD34陽性細胞は2-3週間程度その幹細胞性を維持したまま培養、増殖が可能であることが確認できた。さらに培養後造血幹細胞の表面抗原マーカーの発現においてヒト臍帯血CD34陽性細胞とマウス造血幹細胞とで同様の表面タンパク質の発現が確認できた。さらなる培養の最適化を進めるとともに、その他の表面抗原マーカーがヒト造血幹細胞の培養においても有効なマーカーとなりうるかどうか検討を進めている。

Hematopoietic stem cell function after long-term culture In addition, the optimization of culture conditions enables the proliferation of hematopoietic stem cells. The analysis of hematopoietic stem cells after culture is carried out in a new way. Hematopoietic stem cells in long-term culture, genetic diversity accumulation, whole exon sequencing, evaluation, long-term hematopoietic stem cells in culture, genetic diversity accumulation, correlation. Hematopoietic stem cells are collected and cultured for a long time. At the same time, the frequency analysis of CRISPR gRNA in blood cells and the in vivo reconstruction ability of CRISPR gRNA after introduction of CRISPR gRNA into hematopoietic stem cell transplantation were explored. The phenotype of the candidate gene was determined by the identification of the candidate gene The stem cell culture method was optimized for the use of hematopoietic stem cells. The stem cell culture method was optimized for the use of hematopoietic stem cells. CD34 positive cells in umbilical blood were cultured and cultured for 2-3 weeks. The development of surface antigen in cultured hematopoietic stem cells was confirmed by CD34-positive umbilical cord blood cells and surface antigen in cultured hematopoietic stem cells. As the optimization of culture progresses, the cultivation of hematopoietic stem cells with other surface antigens becomes more effective.